稻瘟病抗性基因Pita特异性分子标记的开发及应用

华丽霞, 张 姝, 苏 菁

(1.四川省农业科学院植物保护研究所, 四川 成都 610066; 2.四川省农业科学院经济作物育种栽培研究所，四川 成都 610300; 3.广东省农业科学院植物保护研究所, 广东 广州 510640; 4.广东省植物保护新技术重点实验室, 广东 广州 510640)

稻瘟病抗性基因Pita特异性分子标记的开发及应用

华丽霞1,2, 张 姝1, 苏 菁3,4

(1.四川省农业科学院植物保护研究所, 四川 成都 610066; 2.四川省农业科学院经济作物育种栽培研究所，四川 成都 610300; 3.广东省农业科学院植物保护研究所, 广东 广州 510640; 4.广东省植物保护新技术重点实验室, 广东 广州 510640)

Pita是一个具有广谱抗性的稻瘟病抗性基因，已经被引入到各稻区的抗性育种工作中。在基于分子标记辅助选择的水稻抗性育种工作中，为了提高对Pita的筛选效率，本研究以导致Pita第918个氨基酸发生变异的单碱基差异为靶标，开发得到Pita基因特异性分子标记，Pita918。研究结果表明，Pita基因特异性分子标记能准确地将Pita与各抗性基因及感病等位基因区分开，这将为育种家提供了直接而高效的Pita筛选标记。同时，本研究还利用该标记对收集自华南及西南稻区的13个水稻地方抗性品进行基因检测，结果显示这13个品种均不携带有抗性基因Pita，表明Pita基因特异性分子标记在水稻抗性材料的基因型鉴定中具有应用价值，有助于育种家挖掘新的抗性基因材料。

水稻；稻瘟病；抗性育种；分子标记；MAS

植物病害可以对产量造成直接的影响，严重的时候可以引起粮食危机，如1845年发生在欧洲的马铃薯晚疫病。为此，育种家们一直致力于对不同的作物进行抗性改良。水稻(OryzasativaL.)是世界范围内重要的粮食作物之一，成为世界上过半人口的主要口粮[1]。然而，水稻的产量每年都受到各种水稻病害的威胁，其中由稻瘟病菌(Magnaportheoryzae；无性态：Pyriculariaoryzae)引起的稻瘟病对水稻的产量产生了严重的影响，造成严重的粮食损失[2-3]。抗性品种的使用被公认为是控制稻瘟病大流行最环保、最经济有效的方法[2, 4-5]。然而，稻瘟病菌生理小种的遗传易变性严重妨碍了抗性品种的使用寿命，携带单个主效抗性基因的水稻品种在推广3～5年后，由于毒性菌株逐渐成为优势小种，最终使品种抗性丧失[6]。因此，育种家需要不断挖掘新的抗性材料，培育出具有优良农艺性状的抗性品种。然而，通过传统的表型鉴定来筛选新抗源材料不仅周期长，而且容易受环境因素的影响。因此，如何从大量的水稻种质资源中快速有效地筛选出新的抗源材料是育种家需要解决的一个问题。

水稻的2个亚种，粳稻及籼稻全基因组测序的相继完成[7-8]，为水稻的基因组学研究提供了丰富的序列信息，加快了多态性分子标记，特别是基于PCR(polymerase chain reaction，聚合酶链式反应)技术的分子标记的开发，加速了控制包括稻瘟病抗性在内的重要农艺性状基因的定位、分离及克隆等工作。分子标记辅助选择(marker-assisted selection，MAS)则是在分子标记快速发展的情况下衍生出来的，这一技术的出现大大提高了对目标性状的定向选择效率[9]。

到目前为止，已经克隆的稻瘟病抗性基因达26个(http://www.ricedata.cn/)。在这些已克隆的稻瘟病抗性基因中，部分是以复等位基因的形式存在于不同水稻品种的同一染色体位置中，这些等位基因虽然在序列上只有少数几个碱基的差异，但是能够抵抗不同的稻瘟病生理小种，典型的如Pik位点上的等位基因簇，该位点上包含了Pik-m、Pik、Pik-p、Pi1、Pik-h等几个序列高度相似，抗谱却有所不同的等位基因[10-14]。稻瘟病抗性基因的克隆及序列信息的公布使基因特异性分子标记的开发成为可能。基因特异性分子标记是指基于基因内部多态性序列所开发的分子标记[15]。与紧密连锁的分子标记相比，基因特异性分子标记在抗性基因的筛查以及基于MAS技术的抗性育种工作中更具优势。Hayashi 等[16]在Pit启动子区域、编码区分别开发得到稻瘟病抗性基因Pit的特异性分子标记，通过分子标记鉴定，在种资质源筛选得到5个Pit类型的抗性基因。华丽霞等[15]成功开发得到Pi2/9/zt的基因特异性分子标记，完成对101个水稻品种的基因型筛查，为育种家对抗源材料的选择提供重要的参考信息。Pita是一个具有广谱抗性的稻瘟病抗性基因，已经被广泛应用于水稻抗性育种工作中[17-18]。虽然国内外关于Pita分子标记开发的研究已经有报道，但是这些分子标记抑或是位于Pita侧翼，抑或是显性标记，在应用过程中容易对目标基因造成错选或漏选[19]。研究结果表明，Pita所编码的氨基酸第918个位点由丙氨酸突变为成丝氨酸将引起基因功能的丧失，并且该突变在水稻种质资源中具有普遍性[20-21]。基于前期的研究结果，本文将以导致Pita第918个氨基酸发生变异的SNP(Single Nucleotide Polymorphism，单核苷酸差异)为靶标位点，以此开发得到稻瘟病抗性基因Pita特异性共显性分子，旨在为水稻育种学家在稻瘟病抗性育种工作方面提供直接而有效的分子标记。

1 材料与方法

1.1 水稻材料

本研究所用的材料有：Pita供体品种IRBLta-K1；携带有不同抗性基因的水稻品种IRBL9-W (Pi9)、 C101A51 (Pi2)、IRBLzt-T (Piz-t)、C101LAC (Pi1)、IRBLa-A(Pia)、 IRBLk-Ka (Pik)作为阳性对照；感病品种Nipponbare、CO39以及丽江新团黑谷LTH作为阴性对照。

1.2 引物设计

Pita全基因序列来自Genbank数据库(收录号：AF207842)；感病等位基因序列来自日本晴基因组上的参考序列(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)；序列比对用DNAStar (http://www.dnastar.com/)的子软件Seqman进行。CAPS/dCAPS标记通过在线软件dCAPS finder 2.0 (http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html)[22]来开发。

1.3 分子标记的检测方法

用新型快速植物基因组DNA提取试剂盒(BioTeke, cat#DP3112)提取水稻叶片总DNA；引物序列由上海生工生物工程技术有限公司合成；PCR反应体系总体积为20 μl，其中包括2 μl的10×PCR buffer (Mg2+Plus)，1.6 μl的dNTPs (2.5 mM each，TAKARA)，各1 μl正反向引物(10 μM)，0.1 μl的TaKaRaTaqTM(5 U/μl)，水稻基因组DNA 50 ng/μl；反应程序为：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35 个循环；72 ℃ 5 min。

用限制性内切酶PvuII (15 U/μl，TAKARA)对PCR产物进行酶切，酶切体系总体积为12 μl，其中包括1.2 μl的10×M buffer，6 μl的PCR产物，1 μl的内切酶，酶切反应条件为37 ℃酶切3 h。酶切产物用8 %的聚丙烯酰胺变性电泳凝胶中电泳检测，90 V，120 min。

2 结果与分析

2.1Pita基因特异性分子标记的开发

通过序列比对，找到抗感等位基因之间导致Pita第918位氨基酸发生突变的SNP，如图1所示。利用dCAP标记开发原理，在正向引物3'末端引入错配碱基(图1，小写字母)，与Pita特异SNP构成一个可以被限制性内切酶PvuII识别的位点CAGCTG(图1)。在SNP下游设计反向引物，扩增获得可用于酶切鉴定的扩增产物(表1)。

表1 Pita特异性分子标记相关信息

注：F：正向引物；R：反向引物。

Note：F:Forward primer; R:Reverse primer.

斜体字母代表导致Pita第918个氨基酸发生突变的SNP，下划线所代表的是编码第918个氨基酸的三联密码子，其中GTC编码氨酸(Alanine),TCT编码丝氨酸(Serine)；双下划线代表正向引物，小写字母为3'，未端引入的错配编碱基图1 Pita与感病等位基因之间的序列对比Fig.1 Sequence align ment of Pita and its orth logs

2.2Pita基因特异性分子标记的验证

以携带不同抗性基因的水稻品种作为阳性对照，以感病品种作为阴性对照，对该标记进行多态性检测。用上述引物对各水稻品种总DNA进行扩增，用限制性内切酶PvuII对扩增产物进行酶切后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，结果表明，该标记能清楚地将Pita与各抗性基因及感病等位基因区分开(图2)。

2.3 用Pita基因特异性分子标记对抗性材料进行检测

为了减少抗性育种工作的盲目性，提供育种效率，在育种初期应该对水稻材料进行抗性遗传背景的分析，因此用基因特异性分子标记对水稻品种资源进行抗性基因筛查便显得十分重要。Pita是一个具有广谱抗性的稻瘟病抗性基因，适合引入到各稻区的抗性育种工作中。本研究用所开发的Pita基因特异性分子标记对收集自华南及西南稻区的13个水稻地方品进行基因检测。这13个地方品种在自然条件对稻瘟病具有一定的抗性，对抗性育种工作及新抗性基因的挖掘具有一定的应用价值。然而，在这13个地方品种中，并没有检测到Pita基因，说明这13个地方品种的稻瘟病抗性并不是由稻瘟病抗性基因Pita所介导的(图3)，这些抗源材料可能携带有其它稻瘟病抗性基因。

M:DL2000;Line 1:cv.IRBLta-K1(Pita);Line 2:cv.IRBL9-W(Pi9);Line 3:cv.C101A51(Pi2);Line 4:cv.IRBLzt-T(Piz-t);Line 5:cv.C101LAC(Pi1);Line 6:cv.IRBLa-A(Pia);Line 7:cv.IRBLk-Ka(Pik);Line 8:cv.Nipponbare;Line 9:cv.CO39.Line 10:cv.LTH.图2 Pita特异性分子标记的多态性检测Fig.2 Polymorphsim validation of Pita-specific marker

M:DL2000; Line 1:cv. IRBLta-K1 (Pita); Line 2-14:Resistance rice landraces图3 Pita特异性分子标记对水稻抗性材料的基因型检测Fig.3 Genotype analysis of resistance rice materials by Pita-specific DNA marker

3 讨 论

抗性育种的关键在于：①获得抗源材料；②快速准确地将目标基因导入到待改良的品种中。分子标记辅助选择(MAS)是随着现代分子生物学技术的迅速发展而产生的分子技术，可以准确快速地分析个体的遗传组成，实现对目标性状的定向选择，为作物的分子设计育种提供重要的技术工具。在水稻抗性育种方面，分子标记辅助选择已经逐渐被用于优良品种、不育系等品种的抗性改良中，主要集中在抗性基因的渗入及基因聚合等方面[23-25]。官华忠等[26]以水稻品系LAC23 (Pi1)作为抗性供体亲本，保持系金23B为受体亲本，以回交转育为基础，利用与Pi1连锁的分子标记RM224或MRG4766对后代进行筛选，最终育成了抗稻瘟病籼型三系不育系金抗1A，其抗性不仅达到了LAC23 (Pi1)的抗性水平，而且还保持了金23A的优良农艺性状。

在抗性育种工作中，分子标记与目标基因的连锁程度对MAS技术的效率有着重要的影响。而与紧密连锁的分子标记相比，基因特异性分子标记与目的基因完全共分离，实现了对目的基因的直接选择，不受遗传背景以及遗传重组的影响，适合的群体较广，在应用上更具优势[15]。基因特异性分子标记有着重要的应用价值，在分子育种中，还可用于对水稻种子资源进行分子鉴定，了解各抗性基因在种质资源中的分布情况，不仅为抗性育种工作的开展提供重要的参考信息，使主效抗性基因在抗性育种工作中实现合理地使用，同时还可以对抗源材料的抗性遗传背景进行分析，为育种家快速鉴定到新的抗源材料提供重要的技术手段。此外，用基因特异性分子标记对大田水稻生产品种进行抗性基因存在与缺失情况的监测，可以及早地发现因不明原因而造成基因丢失的品种，这对预防稻瘟病的流行起到一定的作用。随着越来越多的功能基因被分离克隆，基因特异性分子标记的这些潜在应用价值将促使其在未来研究中越来越受到重视。

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(责任编辑 李 洁)

Development and Application of Specific DNA Marker for Rice Blast Resistance Gene,Pita

HUA Li-xia1,2, ZHANG Shu1, SU Jing3,4

(1.Plant Protection Research Institute, Sichuan Academy of Agricultural Sciences, Sichuan Chengdu 610066，China; 2.The Industrial Crop Research Institute, Sichuan Academy of Agricultural Sciences, Sichuan Chengdu 610300，China; 3.Plant Protection Research Institute, Guangdong Academy of Agricultural Sciences,Guangdong Guangzhou 510640，China; 4.Guangdong Provincial Key Laboratory of High Technology for Plant Protection, Guangdong Guangzhou 510640，China)

Pitais a broad-spectrum resistance gene for rice blast and has been applied in different rice resistance breeding programs. In order to improve the efficiency forPitaselection based on molecular marker-assistant selection (MAS), a gene-specific dCAPs marker, Pita918, targeted on single nucleotide polymorphism that result in single amino acid changed between resistant and susceptible allele ofPitaon 918th aa has been developed in this paper. The result showed thatPitaspecific DNA marker Pita918 can distinguishPitafrom otherRgenes and susceptible allele gene clearly, providing breeders an efficient and accurate marker forPitaselection. Additionally, Pita918 has been used for genotype characterization among 13 resistant rice landraces collected from south and southwest of China, the result showed that those landraces do not harboringPitafor their rice blast resistance, suggesting that Pita918 is a valuable DNA marker for genotype identification in rice germplasm, which will give breeders abundant genetic information in new resistance genes discovery.

Rice; Rice blast; Resistance breeding; Molecular marker; MAS

1001-4829(2016)10-2275-04

10.16213/j.cnki.scjas.2016.10.004

2015-12-30

四川省财政创新能力提升工程青年基金项目(2014CXSF-023)；国家自然科学基金资助项目(31301304)；国家科技(转基因)重大专项(2014ZX0800904B)；公益性行业科研专项(201203014)；现代农业产业技术体系建设专项(CARS-01-24)

华丽霞(1983 -)，女，广东英德人，博士研究生，主要从事作物病害方面的研究, E-mail：newpage@stu.scau.edu.cn。

S511

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