芹菜素对烟草烟雾提取物诱导血管内皮细胞损伤的作用

时文波，于常声，甘　为

山东电力中心医院，济南 250000



芹菜素对烟草烟雾提取物诱导血管内皮细胞损伤的作用

时文波*，于常声，甘为

山东电力中心医院，济南 250000

[摘要]目的探讨芹菜素改善烟草烟雾提取物诱导的血管内皮细胞损伤的机制。方法培养人脐静脉内皮细胞株，给予烟雾提取物(CSE)模拟吸烟环境和不同浓度芹菜素。实验分为正常对照组、CSE组、芹菜素组，检测细胞存活率、凋亡率、细胞内活性氧ROS水平，以及细胞上清液中IL-6、TGF-β、INF-γ各因子的表达。结果芹菜素在24 h和48 h均能显著缓解不同浓度CSE诱导的内皮细胞存活率的降低，降低不同浓度CSE诱导的内皮细胞的凋亡率，同时芹菜素可抑制CSE诱导的细胞内ROS水平，以及上清液中炎性因子IL-6、TGF-β、INF-γ的升高，差异均有统计学意义(P<0.05，P<0.01)。结论芹菜素以血管内皮细胞凋亡和炎性反应为标靶，抑制吸烟引起的血管内皮细胞损伤，为临床治疗提供理论依据。

[关键词]芹菜素；烟草烟雾提取物；血管内皮细胞

0引言

国内外研究发现，血管内皮细胞损伤可导致慢性阻塞性肺疾病和动脉粥样硬化等心血管病变发生，其主要的作用机制为细胞凋亡和线粒体功能异常等。吸烟是公认的动脉粥样硬化发展的独立危险因素，后者严重威胁现代人类的生命健康，可导致内皮炎症反应增加和功能紊乱等诱发急性心血管事件的发生[1]。血管内皮细胞损伤是慢性阻塞性肺疾病的重要发病机制之一，可以通过直接作用或通过炎症介质的释放等多种方式损伤血管内皮细胞。芹菜素(Apigenin)属于黄酮类植物抗毒素，以植物黄色素的形式存在于多种中药中，如紫苏、马鞭草、玄参等，具有低毒性和无诱变性的药理特点。其具有抑制血管炎症反应、抗氧化应激、镇静安神、降压、改善血管内皮功能等作用[2]，但对内皮细胞损伤的保护机制尚未明确。本文从体外研究芹菜素对吸烟诱导的血管内皮细胞损伤的干预作用，现报道如下。

1资料与方法

1.1试验药物芹菜素(Apigenin)，购自Sigma公司，用DMSO溶解后，用培养基配制成以下浓度：10、30、50、70 μmol/L。烟草烟雾提取物(CSE)，购自Sigma公司，分别用相应培养基配制成以下浓度：1%、5%、10%。

1.2动物或细胞人脐静脉内皮细胞株HUVEC，购自中国医学科学院中国协和医科大学基础所细胞中心。HUVEC细胞株采用DMEM培养液和10%胎牛血清混合的完全培养基，每5~6 d，细胞达到80%~90%的融合率，进行传代，37 ℃、5% CO2培养孵箱培养，本实验使用第3代细胞。取对数生长期的细胞进行实验。

1.3试剂PBS缓冲溶液、胎牛血清、DMEM培养基、胰蛋白酶和双抗(青霉素100 μg/mL，链霉素100 μg/mL)均购自Gibco公司；活性氧ROS检测试剂盒购自碧云天生物科技公司；PE-Annexin V/7-AAD试剂盒购自BD公司。

1.4仪器流式细胞仪(美国BD公司)，酶标仪(美国Thermo公司)，荧光显微镜(尼康公司)。

1.5方法

1.5.1MTT比色法测定不同时间各组细胞的存活率细胞培养后，胰酶消化细胞并计数，细胞铺板在1×104/孔(96孔)培养基，100 μL/孔。细胞贴壁4 h后，用含5% FBS的DMEM培养基配制各加药组，将细胞随机分组，每组设置5复孔。继续培养24、48 h后，MTT法检测细胞活性。直接向每孔加入20 μL已配制好的MTT溶液(5 mg/mL)，37 ℃孵育4 h，吸净上清，然后加入150 μL DMSO。待结晶充分溶解后，利用酶标仪在波长490 nm处测定OD值。以MTT比色法测定各组细胞的存活率。

1.5.2细胞凋亡的影响收集细胞培养旧液以及PBS洗涤3次后的洗涤液，用不含EDTA胰酶细胞的消化液消化1~2 min，加入完全培养液，吹打，细胞消化后，转移到离心管内，350 r/min离心5 min，去上清，PBS重悬，350 r/min离心5 min，重复2次，加入100 μL结合缓冲液重悬细胞。加入5 μL PE-Annexin V和5 μL 7-AAD染色液轻轻混匀，室温避光孵育15 min，再加400 μL结合缓冲液，30 min内上机检测，每份样品检测104个细胞。在双变量流式细胞仪的散点图上，显示右下象限为凋亡细胞显现(PE-Annexin V+/7-AAD-)，左下象限为活细胞(PE-Annexin V-/7-AAD-)；右上象限是晚期凋亡细胞(PE-Annexin V+/7-AAD+)。

1.5.3细胞内活性氧ROS水平检测培养12 h后，把细胞培养液吸至离心管内，PBS洗涤贴壁细胞3次，收集洗涤液至离心管内，用胰酶细胞消化液消化1~2 min，加入完全培养液，吹打，细胞消化下来后，转移到离心管内，350 r/min离心5 min，去上清，加0.5 mL培养基重悬细胞，加入稀释好的DCFH-DA(10 μmol/L)中，置37 ℃、5% CO2培养箱内孵育30 min，流式细胞仪检测荧光强度。

1.5.4细胞上清液中炎症因子检测釆用ELISA酶联免疫吸附法，按照白细胞介素-6(IL-6)、TGF-β、INF-γ各因子ELISA Kit说明书操作，5 min内用酶标仪在450 nm波长处测定各孔的OD值。

2结果

2.1细胞存活率检测结果MTT法检测结果显示，24 h与48 h时，不同浓度CSE对HUVEC细胞活力的影响差异有统计学意义(P<0.01)。见表1、表2。50 μmol/L芹菜素可以显著提高不同浓度CSE作用HUVEC细胞后的存活率(P<0.05，P<0.01)；同时在5% CSE作用下，不同浓度芹菜素(10、30、50、70 μmol/L)可以显著提高细胞存活率(P<0.01)。见表3。50 μmol/L芹菜素作用后，细胞存活率趋于平台期，故选用50 μmol/L进行后续的实验。

表1　芹菜素对不同浓度CSE作用后细胞存活率的影响(24 h)

注：与CSE组比较，*P<0.05，**P<0.01

表2　芹菜素对不同浓度CSE作用后细胞存活率的影响(48 h)

注：与CSE组比较，**P<0.01

2.2凋亡率检测结果24、48 h时1%、5%、10% CSE组的凋亡率随浓度升高而明显升高(P<0.01)，而芹菜素组的凋亡率均显著低于对应浓度的CSE组，差异有统计学意义(P<0.01)。芹菜素在24 h和48 h均能改善CSE诱导的内皮细胞的凋亡。见表4。

表3　不同浓度芹菜素对5% CSE作用后细胞存活率影响

注：与对照组比较，*P<0.01

注：与相应浓度CSE组比较，**P<0.01；与空白对照组比较，##P<0.01

2.3各组细胞上清液中炎性因子检测结果随着CSE作用浓度的升高，1%、5%和10% CSE组的IL-6、TGF-β、INF-γ含量明显升高(P<0.01)，而在不同CSE浓度下芹菜素各组的IL-6、TGF-β、INF-γ含量对应浓度CSE组显著降低，差异有统计学意义(P<0.01)。芹菜素可抑制CSA诱导的内皮细胞上清液中炎性因子IL-6、TGF-β、INF-γ的升高。见表5。

表5　细胞上清液中炎性因子检测结果(pg/mL)

注：与相应浓度CSE组比较，**P<0.01；与空白对照组比较，##P<0.01

2.4活性氧ROS检测结果24 h和48 h时，1%、5%和10% CSE组的细胞ROS水平明显升高(P<0.05，P<0.01)，而在不同CSE浓度下，芹菜素各组的细胞ROS水平较对应浓度的CSE组显著降低，差异有统计学意义(P<0.01)。芹菜素在24 h和48 h均能降低CSE诱导的内皮细胞ROS水平的升高。见表6。

3讨论

吸烟是公认的动脉粥样硬化发展的独立危险因素以及慢性阻塞性肺疾病(COPD)最重要的危险因素。吸烟可以引起癌症、慢性肺脏疾病、血管疾病以及口腔疾病，影响着人类的健康。研究发现，吸烟使人类的平均寿命减少12~15岁。动脉粥样硬化严重威胁现代人类生命健康，可导致内皮功能紊乱，炎症反应增加，血液脂肪酸、脂蛋白等代谢异常，血管内血栓形成，易诱发急性心血管事件的发生[1,3]。血管内皮细胞损伤是心血管病变包括动脉粥样硬化等的主要发病机制和风险因素，动脉粥样硬化的发生与病理演变离不开血管内皮细胞的生长、增殖、凋亡、衰老及死亡等细胞过程[4]。而细胞凋亡与线粒体功能异常密切相关[5]。内皮细胞损伤的病理改变可导致血管整体老化，促进了心血管疾病的发生[6]。吸烟者COPD发病率明显高于不吸烟者，吸烟可以通过直接作用或通过炎症因子间接作用损伤肺血管内皮细胞，导致肺血管的慢性炎症以及血管内皮细胞凋亡水平升高。烟草烟雾是烟叶燃烧过程中产生的上千种化学物质的混合物，尼古丁、一氧化碳、活性氧、丙烯醛是烟草烟雾中最重要的几种毒性物质。烟草烟雾中的毒性物质随着细胞中所含的活性氧的升高，激活上皮细胞下游信号途径，导致IL-6、TNF-α等炎症因子的激活，导致血管内皮细胞的炎症反应[7]。因此，寻找新的有效的治疗措施，为心肺脑血管疾病的防治提供新的治疗思路，具有重要的意义。

表6　活性氧ROS检测结果

注：与相应浓度CSE组比较，**P<0.01；与空白对照组比较，##P<0.01

芹菜素主要存在于瑞香科、马鞭草科、卷柏科植物中，如芫花、卷柏中含量较大[8]。属于黄酮类，具有低毒性和无诱变性等特点，属于治疗HIV和其他病毒感染的抗病毒药物，同时是抗肿瘤药物和MAP激酶的抑制剂，具有镇静安神、降压、抗炎、抗氧化等作用。近年来，芹菜素对心血管的保护效应备受关注[9]。芹菜素具有调节血脂、抗氧化应激、抑制血管炎症反应、舒张血管等作用[10-11]，但从抗内皮细胞衰老的角度论述其作用机制的研究较少。

本研究结果表明，芹菜素在24 h和48 h均能抑制不同浓度CSE诱导的内皮细胞存活率降低，并降低不同浓度CSE诱导的内皮细胞的凋亡率，说明芹菜素可干预CSE导致内皮细胞损伤。同时芹菜素可降低CSE诱导的细胞内ROS水平及上清液中炎性因子IL-6、TGF-β、INF-γ的升高。表明芹菜素可改善吸烟诱导的血管内皮细胞活性氧的升高，抑制IL-6、TNF-α等炎症因子的激活，减缓血管内皮细胞的炎症反应及内皮细胞损伤，从而降低引发各种心血管和肺部病变的风险。

综上所述，芹菜素可以抑制吸烟引起的血管内皮细胞的损伤，有效预防动脉粥样硬化和COPD的发生，具有一定的应用前景和临床价值。

参考文献：

[1]Tanriverdi H,Evrengul H,Kuru O,et al.Cigarette smoking induced oxidative stress may impair endothelial function and coronary blood flow in angiographically normal coronary arteries[J].Circ J,2006,70(5):593-599.

[2]Block MJ.Chcmcycolpcdia[M].Washington,DC:American Chemical Society,2001:107.

[3]Erhardt L.Cigarette smoking:an undertreated risk factor for cardiovasculardisease[J].Atherosclerosis,2009,205(1):23-32.

[4]Lavi S,Prasad A,Yang EH,et al.Smoking is associated with epicardial coronary endothelial dysfunction and elevated white blood cell count in patients with chest pain and early coronary artery disease[J].Circulation,2007,15(20):2621-2627.

[5]Ksiazek K,Breborowicz A,Jörres A,et al.Oxidative stress contributes to accelerated development of the senescent phenotype in human peritoneal mesothelial cells exposed to high glucose[J].Free Radical Biology and Medicine,2007,42(5):636-641.

[6]UnterIuggauer H,Hütter E,Voglauer R,et al.Identification of cultivation-independent markers of human endothelial cell senescence in vitro[J].Biogerontology,2007,8:383-397.

[7]马宏,张宗玉,童坦君.衰老的生物学标志[J].生理科学进展,2002,33(1):65-68.

[8]史婷婷,自建平,梁月琴,等.芹菜素对大鼠缺血再灌注心肌细胞凋亡及相关蛋自Bcl-2、Bax、Caspxsc-3表达的影响[J].中国药理学通报,2011,27(5):666-671.

[9]隋海霞,余强,支媛,等.芹菜素对自发性高血压大鼠的降压作用及对肾脏血管紧张素转化酶A表达的影响[J].卫生研究,2010,39(6):693-700.

[10]周鸣鸣,谢焕松,张洁,等.芹菜素改善D-半乳糖衰老模型小鼠衰老指征的研究[J].第二军医大学学报,2007,28(4):452-453.

[11]刘爽,崔卫正.芹菜素对实验性糖尿病大鼠心脏保护作用及其机制研究[J].中国医药,2015,10(4):457-460.

Effect of apigenin on the vascular endothelial cell injury induced by cigarette smoke extractSHI Wen-bo*,YU Chang-sheng,GAN Wei(Shandong Electric Power Central Hospital,Jinan 250000,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the mechanism of apigenin in endothelial cell damage induced by cigarette smoke extract (CSE).MethodsHuman umbilical vein endothelial cells were cultured,with CSE simulating the smoke environment and were given varying concentrations of apigenin.The cells were divided into normal control group,CSE group,and apigenin group. Cell viability,apoptosis rate,intracellular ROS level,and IL-6,TGF-β,INF-γ of cell supernatant were detected.ResultsApigenin could significantly improve the survival rates of endothelial cells with different concentrations of CSE at 24 h and 48 h,and reduce the rate of apoptosis induced by different concentrations of CSE.Apigenin could reduce the elevated levels of ROS induced by CSE and IL-6,TGF-β,INF-γ,there were significant difference(P<0.05,P<0.01).ConclusionApigenin can inhibit endothelial cell damage caused by smoking through apoptosis and inflammatory reactions,and provide a theoretical basis for clinic.

Key words：Apigenin;Cigarette smoke extract;Vascular endothelial cells

DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201601006

*通信作者

收稿日期：2015-06-23