邻苯二甲酸二丁酯人工抗原的制备及免疫鉴定

郑盛武， 赖　丹， 赵肃清

(广东工业大学 轻工化工学院, 广东 广州 510006)



邻苯二甲酸二丁酯人工抗原的制备及免疫鉴定

郑盛武， 赖丹， 赵肃清

(广东工业大学 轻工化工学院, 广东 广州 510006)

摘要：【目的】制备并鉴定1种新型邻苯二甲酸二丁酯人工抗原。【方法】以4-硝基邻苯二甲酸为原料，经过酯化、还原生成4-氨基邻苯二甲酸二丁酯(DBAP)，DBAP再与戊二酸酐反应，衍生生成4-戊二酸单酰邻苯二甲酸二丁酯(DBCP)。将合成的半抗原衍生物DBCP通过活性酯法与牛血清蛋白(BSA)或卵清蛋白(OVA)偶联，得到人工抗原。通过免疫新西兰大白兔获得抗血清，经间接竞争酶联免疫法(icELISA)检测抗体特异性。【结果】经质谱、氢核磁共振谱图鉴定，半抗原衍生物合成成功，经紫外光谱、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫试验证实偶联成功，并计算得出DBCP与载体蛋白BSA和OVA的结合比分别为11∶1和17∶1。经icELISA法检测，兔1和兔2的血清效价均达到1∶128 000，IC50分别为301 和308 ng·mL-1，反应特异性较好。【结论】半抗原衍生物的合成是方便、安全的。邻苯二甲酸人工抗原的成功制备使获得DBP多克隆抗体以及建立DBP免疫分析方法成为可能。

关键词：邻苯二甲酸二丁酯； 人工抗原； 光谱； 免疫鉴定

邻苯二酸酯类化合物(PAEs)又称钛酸酯，是大约30种化合物的总称，主要用作塑料的增塑剂，以增大塑料的可塑性和强度[1]。邻苯二甲酸二丁酯(DBP)是塑化剂的一种，工业上主要用于硝基漆和聚氯乙烯(PVC)塑料的生产，以增强产品的柔韧性。此外，DBP还用于生产防泡剂、乳胶黏合剂和纺织助剂等[2]。塑化剂的大量生产和频繁应用，导致在人们的日常生活中塑化剂污染严重。据报道，中国南京市区的大气塑化剂污染中，DBP占到了58.7%[3]。DBP是一种具有生殖毒性和遗传毒性的环境雌激素，具有雌激素的作用，致突变，对胎儿有毒性，对肌肉、骨骼、中枢神经系统有影响，能通过消化系统、呼吸系统和皮肤进入人体[4]，对人体产生不同程度的危害作用。有研究发现，DBP的代谢产物MBP对大鼠具有胚胎毒性作用，导致胚胎生长缓慢，同时对胚胎有致畸作用[5]。

早在1975年，DBP就被世界野生动物基金会列为具有内分泌紊乱作用的物质之一[6]。DBP还被欧盟2005/84/EC指令限制使用于儿童玩具和用品中，在塑料中的含量不得超过0.1%。美国、加拿大、日本、韩国等多个国家也相继发布了与欧盟类似的法律和标准[7]，我国也将其列为优先控制污染物黑名单[8]。近年来爆发的”台湾塑化剂事件“和“白酒塑化剂事件”，让人们重新认识了作为包装材料添加剂的“塑化剂”，由此引发了对食品包装材料安全性能的高度关注[9]。目前对塑化剂的检测方法主要为气相色谱(GC)、高效液相色谱(HPLC)和质谱(MS)等，但这些方法费时，仪器昂贵，需专业人士操作，样品前处理复杂，不能同时大量分析[10]。本研究采用的免疫分析技术具有特异性强、灵敏度高、方便快捷、分析容量大、检测成本低、安全可靠等优点[11]。

小分子物质邻苯二甲酸二丁酯只有反应原性，没有免疫原性，不能刺激动物发生免疫反应。为了获得具有免疫原性的完全抗原，必须将其与大分子载体进行偶联[12]。本研究利用戊二酸酐合成了连接有5个碳臂长的半抗原衍生物4-戊二酸单酰邻苯二甲酸二丁酯(DBCP)，再通过活性酯法将DBCP与载体蛋白——牛血清蛋白(BSA)或卵清蛋白(OVA)偶联获得人工抗原，最后利用间接酶联免疫法(icELISA)检测抗体。该抗原的合成为免疫分析技术的建立奠定了基础。

1材料与方法

1.1材料与仪器

4-硝基邻苯二甲酸(质量分数≥99%)、钯碳：百灵威化学试剂有限公司；高纯氢气：广州市君多气体有限公司；二环乙基碳二亚胺(DCC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、牛血清蛋白(BSA，质量分数为98.6%)、卵清蛋白(OVA，质量分数为98%)、弗氏完全佐剂与不完全佐剂：美国Sigma公司；SPF级雌性新西兰大白兔：广东省动物中心；羊抗兔IgG-HRP二抗：武汉博士德生物工程有限公司；其他试剂均为国产分析纯。TU-1901紫外-可见分光光度仪：北京谱析通用仪器有限责任公司；RT-2100C型酶标仪：雷杜生命科学股份有限公司；96孔酶标板：厦门云鹏科技有限公司。

1.2人工抗原的合成与鉴定

1.2.14-硝基邻苯二甲酸二丁酯(DBNP)的合成按照文献[13]中的方法，称取20 g(0.095 mol)4-硝基邻苯二甲酸，加入26 mL正丁醇，搅拌下加入3.3 mL浓H2SO4催化，120 ℃搅拌回流7 h后，蒸馏除去未反应的丁醇和生成的水。趁热导入冰水中，油状粗品用质量分数为10%Na2CO3洗涤至水层无色(pH7~8)后，分离出油状物，用无水乙醇溶解除去不溶物，加热后除去少量乙醇，趁热置冰箱中冷却，得到黄色油状液体28.5 g，产率93%。

1.2.24-氨基邻苯二甲酸二丁酯(DBAP)的合成取2 g(6.19 mmol)4-硝基邻苯二甲酸二丁酯和0.4 g钯碳溶于15 mL甲醇，缓慢通入H2，50 ℃条件下回流搅拌反应5 h，反应结束后过滤，上清液旋转蒸发浓缩，用乙酸乙酯溶解后再过滤，旋转蒸发浓缩后得淡黄色固体1.78 g，产率98%。产物经硅胶柱层析提纯，通过氢核磁共振(1H NMR)和质谱(MS)鉴定。

1.2.34-戊二酸单酰邻苯二甲酸二丁酯 (DBCP) 的合成将0.29 g(1 mmol)DBAP和0.22 g(2 mmol)戊二酸酐溶解在20 mL四氢呋喃(THF)中，60 ℃条件下回流搅拌反应8 h，再转移至室温搅拌反应12 h，蒸馏除去THF。残余物溶于10 mL乙酸乙酯中，并用10 mL双蒸水洗涤，分离出乙酸乙酯层，转旋蒸发除去乙酸乙酯，得到黄色油状液体0.31 g，产率75%。

1.2.4人工抗原的合成将40.7 mg(0.1 mmol)DBCP，17 mg(0.15 mmol)NHS完全溶于1 mL的二甲基甲酰胺(DMF)后，加入31 mg(0.15 mmol)DCC，4 ℃条件下反应12 h，离心分离出上清液。取900 μL得到的上清液，滴加到8 mL溶有113 mg BSA的磷酸盐缓冲液(PBS,pH 7.4)中，4 ℃条件下反应12 h。10 000 g·min-1条件下离心10 min。将上清液装入透析袋，用PBS透析3 d，每12 h换液1次，得到棕黄色的邻苯二甲酸全抗原溶液。

1.2.5人工抗原的鉴定为鉴定半抗原与载体蛋白是否偶联成功，分别将半抗原、载体蛋白和偶联物稀释至一定浓度进行SDS-PAGE鉴定，并在200~400 nm波长间进行紫外吸收光谱测定，以紫外分光光度法估算偶联物的结合比[14]。

1.3免疫动物及抗血清检测

以DBCP-BSA作免疫原，用PBS溶液(pH 7.4)稀释至1 mg·mL-1，与等体积的弗氏完全佐剂充分乳化，对2只成年健康雌性新西兰大白兔采用背部多点注射和肌肉注射。3周后再次免疫改用等量的弗氏不完全佐剂进行乳化，以后每隔2周免疫1次，免疫后7~8 d耳缘静脉取血[15]。

以DBCP-OVA作包被原，将抗血清用PBS溶液倍比稀释，采用间接ELISA法检测抗体效价，并用间接竞争ELISA法[16]检测抗体的特异性。以标准品DBP浓度的自然对数值为横坐标，D/D0(D、D0分别为加兔抗血清和阴性血清对应的光密度)为纵坐标，建立竞争抑制曲线。

1.4抗体特异性分析

采用icELISA法分别检测邻苯二甲酸二甲酯(DMP)、邻苯二甲酸二乙酯(DEP)、邻苯二甲酸二异丁酯(DIBP)、邻苯二甲酸单苄酯(MBzP)、4-氨基邻苯二甲酸二丁酯(DBAP)、邻苯二甲酸二环己酯(DCHP)、邻苯二甲酸二正辛酯(DNOP)与抗体的交叉反应，并计算各竞争物的半抑制率(IC50)，比较抗体对它们的亲和性。根据以下公式计算各竞争物与DBP抗体的交叉反应率[17]。

2结果与分析

2.1半抗原衍生物合成结果分析

对半抗原衍生物4-氨基邻苯二甲酸二丁酯(DBAP)和4-戊二酸单酰邻苯二甲酸二丁酯(DBCP)进行了质谱(MS)与氢核磁共振(1H NMR)扫描，结果(图1和图2)表明合成成功。

图1　半抗原衍生物DBAP的1H NMR(a)和MS(b)图谱

由图1a分析可知，DBAP的1H NMR (300 MHz, CDCl3)δ: 7.71 (d,J= 8.4 Hz, 1H), 6.76~6.65 (m, 2H), 4.27 (dt,J= 17.6, 6.7 Hz, 4H), 1.78 ~1.61 (m, 4H), 1.52~1.37 (m, 4H), 0.96 (t,J= 7.3 Hz, 6H)，其MS图(图1b)中293.9是M+H+，315.9是M+Na+，331.9是M+K+，348.1是M+Na++CH3OH，609.1是2M+Na+。由此可知，该化合物的相对分子质量为293，与计算结果吻合。

图2　半抗原衍生物DBCP的1H NMR(a)和MS(b)图谱

由图2a分析可知 DBCP的1H NMR (300 MHz, CDCl3)δ: 9.02 (s, 1H), 7.84 (s, 1H), 7.69 (d,J= 8.0 Hz, 2H), 4.24 (td,J= 6.7, 3.2 Hz, 4H), 2.46 ~2.21 (m, 4H), 2.01 ~ 1.83 (m, 2H), 1.74~ 1.56 (m, 4H), 1.39 (dp,J= 14.4, 7.3 Hz, 4H), 0.92 (q,J= 7.3 Hz, 6H)，其MS图(图2b)中，406.2是M-H+。由此可知，该化合物的相对分子质量为407.2，与计算结果吻合。

2.2抗原的鉴定

2.2.1紫外可见光吸收光谱鉴定经紫外可见光分光光度计测定，得到载体蛋白、半抗原衍生物以及人工抗原的紫外扫描图(图3)。从图3中可以看出，DBCP在波长204、223和269 nm处出现特征吸收峰，载体蛋白BSA在波长202和280 nm处出现特征吸收峰，OVA在205和280 nm处出现特征吸收峰，而DBCP-BSA则在205和272 nm处有显著吸收峰，DBCP-OVA在203和269 nm处有显著吸收峰。由于DBCP的羧基与载体蛋白的氨基发生偶联，所以紫外光谱中特征峰发生改变，但同时具备半抗原和载体蛋白的吸收特征，间接说明半抗原和载体蛋白偶联成功[18]。根据紫外分光光度法估算DBCP-BSA和DBCP-OVA的结合比分别为11∶1和17∶1。

2.2.2 SDS-PAGE鉴定人工抗原及蛋白的SDS-PAGE结果见图4。由图4可知，人工抗原的迁移速率均比载体蛋白的迁移速率小，表明偶联产物的相对分子质量均比载体蛋白的相对分子质量大。其中，DBCP-OVA和OVA在电泳图中的区分效果较好，可能是OVA的相对分子质量较小、结合上的DBCP较多的缘故(结合比17∶1)。电泳图表明半抗原衍生物与载体蛋白偶联成功。

图3　人工抗原紫外扫描图

M1:重组蛋白 Marker 1; 1：BSA；2:DBCP-BSA; M2:重组蛋白 Marker 2; 3：OVA; 4:DBCP-OVA。

图4BSA和DBCP-BSA以及OVA和DBCP-OVA的SDS-PAGE电泳图

Fig.4SDS-PAGE gel of BSA, DBCP-BSA, OVA and DBCP-OVA

2.3抗血清检测

对兔子进行5次免疫后耳部静脉采血，经离心得到抗血清，利用间接ELISA法检测抗体效价，结果见表1。从表1可知，兔1和兔2抗血清效价均达到1∶128 000。包被抗原DBCP-OVA经方阵滴定法确定最佳包被质量浓度为2 000 ng·mL-1。以抗血清最高效价稀释倍数，利用icELISA法测定其半抑制率(IC50)，竞争抑制曲线如图5，可知兔1和兔2的IC50分别为301和308 ng·mL-1。

表1抗血清效价测定结果

Tab.1Detection result of serum titer

血清稀释度D450nm兔1兔21∶20001.70831.45871∶40001.60131.39751∶80001.41571.16471∶160001.24930.94361∶320001.00500.74571∶640000.73700.41481∶1280000.46800.28531∶1000(阴性对照)0.02800.0303

图5　DBP标准竞争抑制曲线

Fig.5Standard competitive inhibition curves for DBP

2.4抗体特异性分析

采用icELISA法对邻苯二甲酸二甲酯、邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二异丁酯、邻苯二甲酸单苄酯等邻苯二甲酸结构类似物进行特异性检测，结果如表2所示。从表2中可以看出，除DBP和DBAP外，其他结构类似物的交叉反应率均小于4.3%。因此，表明DBCP-BSA免疫新西兰大白兔所获抗体建立的icELISA方法特异性良好。

表2多克隆抗体与DBCP结构类似物的交叉反应

Tab.2Cross-reactivity of the polyclonal antibody against DBCP related compounds

交叉反应物IC50/(nmol·mL-1) 交叉反应率/%邻苯二甲酸二丁酯(DBP)1.11004-氨基邻苯二甲酸二丁酯(DBAP)1.764.7邻苯二甲酸二甲酯(DMP)>41.3<2.6邻苯二甲酸二乙酯(DEP)>42.7<2.6邻苯二甲酸二异丁酯(DIBP)>34.1<3.2邻苯二甲酸单苄酯(MBzP)>32.0<3.4邻苯二甲酸二环己酯(DCHP)>30.3<3.6邻苯二甲酸二正辛酯(DNOP)>25.3<4.3

3讨论与结论

半抗原的设计、半抗原的修饰和人工抗原的合成是制备抗小分子化合物抗体、建立相应的免疫分析方法的重要过程。之前的研究中，邻苯二甲酸二丁酯人工抗原的研究多以4-氨基邻苯二甲酸二丁酯为半抗原通过重氮化法与载体蛋白偶联制备[3,11,13],这种方法在半抗原制备过程中通常使用苯等有毒有机溶剂，不利于试验操作人员的健康。其次，重氮化法的操作有一定的危险性，且步骤比较繁琐。Wei等[2]在其研究中曾经制备带4个碳链的邻苯二甲酸二丁酯人工抗原，但在其研究中主要将这种抗原作为包被原来使用，并未深入探究这种抗原的免疫活性。

本研究在DBAP的4位氨基上利用戊二酸酐在半抗原与载体之间连接了1条含5个碳的手臂链，充分暴露出了半抗原分子的特征结构，而且连接了5个碳手臂链，更有利于人工抗原表面突显半抗原的结构特征，以利于产生具有高特异性的抗体[19]。利用H2还原、钯碳作催化剂，大大缩短了反应时间，避免了使用有毒试剂苯，试验操作更安全更简便，也提高了反应产率。使用戊二酸酐反应与戊二醛法反应相比较，产物更稳定，副产物少，专一性更强，产率更高。因此，该抗原的合成为下一步建立免疫分析技术奠定了基础。

本试验使用戊二酸酐反应合成了半抗原衍生物，经质谱、氢核磁共振谱图鉴定，衍生物合成成功。采用活性酯法将半抗原衍生物与载体蛋白进行偶联，合成人工抗原，经紫外光谱、SDS-PAGE鉴定，偶联成功。所得抗体经icELISA法检测知其具有较高灵敏度和较好特异性，可用于邻苯二甲酸二丁酯含量的测定。

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【责任编辑李晓卉】

Synthesis and identification of artificial antigen for dibutyl phthalate

ZHENG Shengwu， LAI Dan， ZHAO Suqing

(Department of Chemical Engineering and Light Industry, Guangdong University of Technology, Guangzhou 510006，China)

Abstract：【Objective】 This study was aimed to prepare and identify a new kind of artificial antigen for dibutyl phthalate. 【Method】 Dibutyl 4-aminophthalate (DBAP) was obtained via esterification and reduction of 4-nitrophthalic acid. The hapten derivative monoglutaryl 4-amino-dibutyl phthalate (DBCP) was prepared through DBAP reacting with glutaric anhydride. DBCP was conjugated to bovine serum albumin (BSA) or ovalbumin (OVA) to make artificial immunogen via activated ester method. Then the antiserum of two female New Zealand white rabbits was obtained after injecting with artificial immunogens which were successfully coupled. Indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay (icELISA) was used to analyze the sensitivity and specificity of the antiserum. 【Result】 The successful synthesis of hapten derivative was identified by mass spectrometry (MS) and1H nuclear magnetic resonance (1H NMR). The successful coupling was proved by ultraviolet spectroscopy (UV) and SDS polyacrylamide gels electrophoresis (SDS-PAGE). Furthermore, the numbers of DBCP molecules per BSA/OVA molecules for two conjugates were 11∶1 and 17∶1 respectively, estimated by ultraviolet spectrophotometry. The icELISA method indicated high specificity for the antiserum with the highest titer being 1∶128 000 for samples from both rabbits, and the IC50being 301 and 308 ng·mL-1respectively. 【Conclusion】 The hapten derivative can be synthesized in a convenient and secure way. The successful synthesis of the artificial antigen for dibutyl phthalate makes it possible to get polyclonal antibodies and establish immunoassay for DBP.

Key words：dibutyl phthalate; artificial antigen; spectrum; immunity identification

中图分类号：R446.6; O65

文献标志码：A

文章编号：1001- 411X(2016)02- 0107- 06

基金项目：国家自然科学基金(41271340)；广东省自然科学基金(2013040013021， S2013030013338)

作者简介：郑盛武(1989—)，男，硕士研究生，E-mail:bntzsw@sohu.com；通信作者：赵肃清(1969—)，男，教授，博士，E-mail: sqzhao@gdut.edu.cn

收稿日期：2015- 05- 25优先出版时间：2016- 01- 18

优先出版网址：http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1110.s.20160118.1651.030.html

郑盛武， 赖丹， 赵肃清.邻苯二甲酸二丁酯人工抗原的制备及免疫鉴定[J].华南农业大学学报，2016,37(2):107- 112.