铜暴露对小鼠铜代谢相关酶表达及氧化应激的影响

孙 倩， 马 佺， 刘建军， 杨细飞，*

(1.深圳大学生命科学学院，广东深圳 518060；2.深圳市疾病预防控制中心，深圳市现代毒理学重点实验室，广东深圳 518055)



铜暴露对小鼠铜代谢相关酶表达及氧化应激的影响

孙 倩1， 马 佺2， 刘建军2， 杨细飞1，2*

(1.深圳大学生命科学学院，广东深圳 518060；2.深圳市疾病预防控制中心，深圳市现代毒理学重点实验室，广东深圳 518055)

摘要[目的] 研究长期低剂量铜暴露对小鼠海马组织铜含量、铜代谢相关酶及氧化应激的影响,为深入研究低剂量铜暴露的神经毒性作用提供基础数据。[方法]选择野生型小鼠，随机分为对照组和试验组对照组小鼠饮用蒸馏水，试验组在饮用水中添加0.13 mg/L氯化铜,连续饮用3个月,研究长期低剂量铜暴露对小鼠海马组织中铜含量、铜代谢相关酶表达及氧化应激的影响。[结果]与对照组相比,试验组小鼠海马中的自由铜及结合铜含量均显著升高，而铁、锌、钙离子含量在海马中均无显著差异；与对照组相比，试验组小鼠海马组织中铜蓝结合蛋白表达显著降低，蛋白硝基酪氨酸水平显著升高，8-羟基脱氧鸟嘌呤荧光表达水平显著升高。[结论]长期超低剂量铜暴露可导致铜在脑组织中聚集，但不影响铁、锌、钙和镁的含量；长期低剂量铜暴露可导致氧化应激。

关键词铜；低剂量；海马组织；氧化应激

Effects of Copper Exposure on Copper Metabolism-related Enzyme Expression and Oxidative Stress of Mice

SUN Qian1,MA Quan2,LIU Jian-jun2,YANG Xi-fei1,2*(1.College of Life Science,Shenzhen University,Shenzhen,Guangdong 518086; 2.Key Laboratory of Modern Toxicology of Shenzhen,Shenzhen Center for Disease Control and Prevention,Shenzhen,Guangdong 518055)

Abstract[Objective] To explore the effects of long-term low level copper exposure on copper concentration,copper metabolism-related enzyme expression and oxidative stress in mice,and to provide basic data for further exploring neurotoxicity of low level copper exposure.[Method] Wide-type (WT) mice were randomly divided into the control group and test group.The mice in control group were provided with drinking water,while mice in test group were given drinking water containing 0.13 mg/L copper chloride for a period of three months.Effects of long-term copper exposure at low level on the copper concentration,oxidative stress and copper metabolism related enzymes were researched.[Result] Compared with control group,free copper and protein binding copper were significantly increased in hippocampus of mice in test group; but the contents of iron,zinc and calcium showed no significant differences.Long-term low levels of copper exposure significantly decreased the expression level of blue copper-binding protein,but increased the levels of nitrotyrosine and 8-OHdG in hippocampus of mice.[Conclusion] Long-term copper exposure at low levels can lead to accumulation of copper but do not affect the content of iron,zinc,calcium and magnesium in the brain,and can cause oxidative stress.

Key wordsCopper; Low level; Hippocampus; Oxidative stress

铜是维持人体正常生理功能至关重要的微量元素，对婴儿生长、机体免疫功能形成、脑组织发育等都具有重要作用。正常成人每天从食物中摄取的铜约2～4 mg/d,吸收部位主要在胃部和小肠上部。铜离子进入血液后先与白蛋白疏松结合,其中90%～98%被运送至骨髓、肝脏、脑等部位,用以合成血浆铜蓝蛋白及细胞色素氧化酶、超氧化物歧化酶、酪氨酸酶等[1]；仅有约5%与白蛋白或组氨酸和多肽疏松结合,其中大部分经胆道系统排泄,极少数由尿中排出。正常人血浆铜浓度约为15 μmol/L，血浆游离铜(非铜蓝蛋白结合铜)浓度过高会使铜代谢失衡[2-3]，导致器官受到损害(如神经系统损伤)。

铜在脑中主要分布在海马、基底核、小脑和突触膜等区域，并与许多中枢神经系统酶的功能相关。通过铜蓄积可以导致铜中毒，如肝豆状核变性(Wilson病)、印度儿童肝硬化和原发性铜中毒[4]；此外，血清游离铜的升高[5]和铜蓝结合蛋白(Cp)合成的减少[6]也与神经退行性疾病相关。通过流行病学调查和动物试验发现，铜代谢失衡还直接或间接地参与一些神经退行性疾病的发病机理，如帕金森病、阿尔茨海默氏症、血浆铜蓝蛋白缺乏症、亨廷顿病等。Morris等[7]发现饮食中富含饱和脂肪、反式脂肪以及较高的铜摄入会加快认知能力的下降。临床上应用氯碘羟喹和D-青霉胺等各种铜鳌合剂促进铜的排出，发现铜鳌合剂可以显著改善老年痴呆患者认知功能的下降[8]。

近年来，国内外对铜毒性的研究大多集中在高剂量铜暴露后引起的毒性效应。然而，实际生活中如此高剂量的铜暴露很少发生，而关于低剂量的铜暴露(相当于人类日常铜摄入剂量的铜暴露)对神经系统的潜在毒性作用尚未见报道。笔者研究了长期低剂量铜暴露对小鼠海马组织中铜含量、铜代谢相关酶表达和氧化应激的影响，以期为长期低剂量铜暴露导致的神经毒性研究提供基础性资料。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物。野生型小鼠(B6129SF2/J)，购自美国 Jackson实验室。试验所用小鼠在SPF级环境饲养，每笼饲养4只小鼠，食物及饮用水充足，环境温度稳定，12 h昼夜交替。动物试验及饲养均符合实验动物饲养标准。

1.1.2试剂与仪器。

1.1.2.1试剂。氯化铜(SIGMA公司)、Tris-盐酸缓冲液(pH 7.4)；铜蓝结合蛋白抗体(Abcam,美国)、蛋白硝基酪氨酸(Nitrotyrosine)(Santa Cruz,美国)、8-羟基脱氧鸟嘌呤(8-OHdG)(Abcam,美国)、兔抗鼠二抗(Thermo,美国)、荧光二抗(Thermo,美国)、辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase,HRP);DAPI和抗荧光淬灭剂，均购自北京中杉金桥生物科技公司。

1.1.2.2耗材与仪器。超滤管(EMD Millipore，美国)、ICP-MS(Agilent Technologies 7700 Series，美国)、激光共聚焦显微镜(Leica，德国)。

1.2方法

1.2.1小鼠分组及染毒。选择3月龄野生型小鼠,将小鼠随机分为2组:对照组及试验组(低剂量铜暴露组),每组各8只小鼠。试验组小鼠以自由饮水的方式饮用含铜水,对照组小鼠饮用蒸馏水,处理时间为3个月。

1.2.2海马组织中铜含量的测定。经铜暴露后处死小鼠，分离小鼠海马组织并收集于EP管中备用。然后，加入50 mmol/L的Tris-盐酸缓冲液(pH 7.4)，将混合液移置超滤管中并以100 000 g离心60 min。将适量氯化铜溶于蒸馏水中配制成浓度为0.13 mg/L的水溶液,且每周新鲜配制。分子量大于3 ku的蛋白结合铜留在超滤管中，分子量小于3 ku的自由铜及其他金属离子则在收集管中。样品检测前需进行消解，预处理后采用ICP-MS进行检测，质谱仪根据离子的质荷比进行分离并进行定性与定量分析。

1.2.3免疫印迹法检测蛋白表达量的变化。部分小鼠海马组织在铜暴露处理后被摘取，并提取其总蛋白进行定量。利用10%SDS-PAGE凝胶电泳，将蛋白转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，室温下以5%脱脂奶粉摇床封闭2 h；然后，加入相应比例的一抗Cp(1∶1 000)和蛋白硝基酪氨酸(1∶200)，以β-actin(1∶500)作为内参于4 ℃条件下过夜；用TBST漂洗PVDF 膜3次，每次10 min，取出PVDF膜后加入辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase,HRP)标记兔抗鼠二抗(1∶3 000)；37 ℃下孵育1 h，TBST 洗膜后化学发光显影曝光。使用Image Quant TL软件分析各条带灰度值。

1.2.4免疫荧光检测小鼠海马组织CA1和CA3区8-OHdG。处理时间结束后，部分小鼠用4%多聚甲醛心脏灌注固定，摘取大脑并置于固定液中36~48 h。常规石蜡包埋，行冠状位连续切片(4 μm)，石蜡切片常规脱蜡后切片于0.3%TritonX-100室温孵育促渗15 min，然后进行抗原修复处理并用3% BSA封闭30 min，完成后滴加8-羟基脱氧鸟嘌呤(8-OHdG)兔抗鼠一抗(1∶1 000)，4 ℃条件下过夜，TBST漂洗3 次，每次5 min，滴加荧光二抗(1∶1 000)室温避光孵育2 h。洗去抗体后，再用DAPI复染。最后，用抗荧光淬灭剂封片后，使用激光共聚焦显微镜进行观察。

1.2.5数据统计与分析。使用SPSS 17.0统计软件对试验数据进行统计与分析，结果均以平均值±标准误表示。组间比较采用t检验，P< 0.05表示差异显著。

2结果与分析

2.1低剂量铜暴露对海马自由铜、结合铜及相关金属含量的影响从表1可以看出，与对照组相比，低剂量铜暴露处理的试验组小鼠海马组织中自由铜和结合铜含量均显著上升(P<0.05)，而低剂量铜暴露处理的试验组小鼠海马中铁、锌、钙、镁离子含量与对照组均无显著差异。

表1　铜暴露对小鼠海马组织中自由铜、结合铜及相关金属含量的影响

注：*表示与对照组差异显著(P<0.05)。

Note:* indicated significant differences with control group (P<0.05).

2.2铜暴露对铜代谢相关酶表达的影响从图1可以看出，在内参蛋白表达量一致的前提下，与对照组相比，低剂量铜暴露处理试验组的Cp表达显著降低(P<0.05)。

注：*表示与对照组差异显著(P<0.05)。Note:Compared with control group,* indicated significant differences (P<0.05).图1　铜暴露对铜代谢相关酶表达的影响Fig.1　Effects of copper exposure on the expression of metabolism related enzymes

2.3铜暴露对氧化应激指标的影响从图2可以看出，低剂量铜暴露试验组小鼠蛋白硝基酪氨酸水平显著增加(P<0.05)。从图3可以看出，与对照组相比，低剂量铜暴露处理的试验组小鼠8-OHdG荧光强度显著增强 (P<0.05)，说明8-OHdG的水平显著升高。这些结果表明长期低剂量铜暴导致小鼠海马组织氧化应激增强。

注：*表示与对照组差异显著(P<0.05)。Note:Compared with control group,* indicated significant differences (P<0.05).图2　铜暴露对氧化应激指标的影响Fig.2　Effects of copper exposure on the index of oxidative stress

注：A.CA1区；B.CA3区。　　　Note:A.CA1 region; B.CA3 region.图3　各组小鼠海马组织CA1和CA3区8-OHdG的免疫荧光检测Fig.3　Immunofluorescence analysis of 8-OHdG in CA1 and CA3 regions of mice hippocampus

3讨论与结论

铜可引起神经退行性变，导致学习和记忆损伤等多种神经毒性作用[9]。当铜代谢失衡时可以造成活性氧、活性氮的生成，从而造成持续的氧化应激反应，从而导致神经元凋亡等神经退行性病变[10]。

近年来，低剂量的铜暴露引起的毒性作用越来越受到关注。Sparks等[11]研究发现低剂量铜暴露能增加高胆固醇饮食的兔子脑中β淀粉样蛋白增多。随后，又在自发血胆固醇升高的兔子模型、高胆固醇饲养的比格犬以及PS1-APP转基因小鼠模型中得到了验证[5]。Singh等[12]研究发现低剂量铜暴露后铜能通过低密度脂蛋白相关蛋白1来调节正常健康小鼠脑中Aβ穿过血脑屏障，从而大量积累形成淀粉斑，最终产生神经毒性。

然而，这些研究仍未对低剂量的铜暴露后是否会引起脑组织中不同形态的铜含量的变化以及是否会导致铜代谢相关酶的变化等基础性问题进行探讨。该研究表明长期低剂量铜暴露的小鼠海马组织中自由铜和结合铜水平均显著高于对照组，说明非常低剂量的长期铜暴露亦可引起铜在小鼠海马组织中的聚集。通过检测海马中Cp的表达，发现Cp表达显著降低，说明长期低剂量铜暴露可以显著影响铜代谢的变化，铜代谢相关酶的表达变化可能解释了铜暴露后脑中非蛋白结合铜，即游离铜含量显著升高的原因。笔者还通过检测氧化应激损伤的敏感标志物(即蛋白硝基酪氨酸和8-OHdG)，发现二者的水平均均显著提高，说明非常低剂量的铜暴露亦可导致小鼠脑组织发生氧化应激反应，引起神经毒性作用。研究发现长期低剂量铜暴露可导致铜在脑组织中聚集，自由铜和结合铜的水平均显著升高，并导致氧化应激。该研究结果可为深入研究低剂量铜暴露引起的神经毒性提供基础数据。

参考文献

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收稿日期2015-12-24

作者简介孙倩(1991-)，女，广东深圳人，硕士研究生，研究方向：生态毒理学。*通讯作者，研究员，博士，从事现代毒理学研究。

基金项目广东省自然科学基金项目(2014A030313715)；深圳市科技研发基金基础研究项目(JCYJ20130329103949650)。

中图分类号S 865.1+3

文献标识码A

文章编号0517-6611(2016)03-022-03