血液分析仪新型荧光血小板计数法的基本性能评价

崔晓阳　冯春颜　朱彩云　张刘兵　周卫



血液分析仪新型荧光血小板计数法的基本性能评价

崔晓阳①深圳市龙华新区人民医院检验科 广东 深圳 518109冯春颜①朱彩云①张刘兵①周卫①

[摘要]目的：对XN3000血细胞分析流水线新型荧光血小板(PLT-F)计数法的基本性能进行评价。方法：对新型PLT-F计数的总重复性、精密度、携带污染率、线性稀释、抗红细胞碎片干扰以及与显微镜血小板(PLT-M)计数法的相关性等基本性能进行评估。同时进行鞘流电阻抗血小板(PLT-I)计数和光学血小板(PLT-O)检测。结果：总重复性为1.40%，平均批内精密度为1.36%，批间精密度为1.93%，携带污染率为0.00%～0.97%，均值为0.48%；在线性稀释试验中，测试值与理论值的相关系数(r)为0.999；PLT-F对红细胞碎片有较强的抗干扰能力；PLT-F血小板计数值与PLT-M结果相关性良好，且低值血小板组(PLT＜100×109/L)，3种检测方法的相关系数r值PLT-F＞PLT-O＞PLT-I。结论：PLT-F法精密度、准确度及线性较好，红细胞碎片的抗干扰能力强。低值血小板计数与PLT-M相关性好，优于PLT-I法。日常检验中使用PLT-I法计数血小板，若计数血小板异常减少或出现散点图异常干扰时，必须用显微镜计数法或PLT-F法进行复查。

[关键词]XN系列血液体液分析仪；血小板计数；性能评价

[First-author’s address] Department of Laboratory Medicine, People’s Hospital of New District Longhua Shenzhen, Shenzhen 518109, China.

XN3000血细胞分析流水线是由2台XN10全自动血液体液分析仪与1台SP10推片机组成。XN系列可定制化的全自动模块式血液体液分析系统，可提供全血模式33个报告参数和31个研究参数，体液模式6个报告参数和12个研究参数。XN系列血液体液分析仪改进和新增了一系列检测通道，包括用于测量白细胞分类(white cell differential channel，WDF)、测量有核白细胞(white cell nucleated channel，WNR)、嗜碱性细胞和红细胞、测量异常和(或)未成熟细胞及白细胞前体(white cell precursor channel，WPC)和用于荧光血小板(fluorescent platelet channel，PLT-F)计数通道。在血小板计数方法上，XN系列同时保留上一代XE系列血细胞分析仪鞘流电阻抗(impedance，PLT-I)法和光学(optics，PLT-O)法。PLT-F法采用新型核酸荧光染料并增加了血小板计数粒子量，使得血小板计数的准确性和精度得到进一步提高。本研究采用PLT-I、PLT-O和PLT-F的3种方法对血小板进行检测，并对3种检测方法的总重复性、精密度、线性范围、携带污染、抗红细胞碎片干扰以及与手工(manual，PLT-M)法相关性等性能进行评估[1]。

1　材料与方法

1.1 评价样本

选取门急诊患者、住院患者及体检者送检样本120例，其中各种病因引起PLT减少血样43例(100×109)/L。

1.2 仪器设备与试剂

采用日本Sysmex公司XN3000血细胞分析流水线，Olympus光学显微镜以及改良牛鲍计数板等。

Sysmex XN3000血细胞分析流水线试剂为原装配套试剂、配套全血质控品。血小板计数草酸铵法稀释液按《全国临床检验操作规程》第3版要求严格配制[2]。

1.3 检测方法

1.3.1 总重复性试验

随机选择高值、低值PLT样本5例，中值样本10例，在0 h、2 h和4 h时分别以PLT-I、PLT-O以及PLT-F方法进行测量[3]；所得数据计算总重复性变异系数CV(%)值为公式1：

式中n为重复测定次数(本试验重复测定次数为3次)；u为样本数；x-为均值。

1.3.2 批内精密度试验

随机选取低值、中值及高值PLT样本各1份，分别采用PLT-I、PLT-O以及PLT-F方法连续测量10次，分别计算标准差(SD)和变异系数CV(%)值。

1.3.3 批间精密度试验

选择省临检中心全血质控品1例，每日随常规样本进行检测，连续测量20 d，计算均值(x-)、SD和CV(%)值。

1.3.4 携带污染试验

高值PLT样本测量(H1、H2、H3)3次后，立即对低值样本进行重复测量(L1、L2、L3)3次后，计算携带污染率采用公式2：

1.3.5 线性稀释试验

选择PLT-M计数均值为482×109/L的血样1例，再以稀释度(5点法)计算值作为理论值，各稀释度以PLT-I、PLT-O和PLT-F的3种测试方法分别进行测量2次，取平均值与理论值作回归分析，并以100×109/L为界分组进行相关性分析。

1.3.6 红细胞碎片干扰试验

取血离心后，取红细胞层0.5 ml并加入蒸馏水破坏RBC，再次离心，用生理盐水洗涤3次后，稀释至5 ml，作为高浓度RBC碎片备用(实验时加20 μl至试验血样中)；再取0.5 ml稀释至5 mL作为低浓度RBC碎片备用(实验时加20 μL至试验血样中)；对照管中加等量生理盐水。最后，采用PLT-I、PLT-O和PLT-F测试方法进行测试，对照组和干扰组测试值作配对t检验。

1.3.7 相关性试验

随机抽取日常送检样本100例，采用PLT-I、PLT-O和PLT-F的3种测试方法分别进行测量2次，PLT-M由2名经验丰富，具有中级职称的检验师采用双盲法进行计数，结果取2人均值。以PLT-M法为参考方法，PLT-I、PLT-O及PLT-F测定值分别与PLT-M法进行相关性和线性回归分析。

1.4 统计学方法

采用SPSS 17.0软件处理所有数据，计数资料以均数±标准差(x-±s)表示，测试值作配对t检验。

2　结果

2.1 总重复性试验结果

采用PLT-I、PLT-O和PLT-F检测的3种方法总重复性分别为1.46%、1.53%和1.40%。

2.2 批内精密度结果

对低值、中值和高值3份不同浓度的血小板血样进行检测，3种方法在各水平上的血小板检测精密度均符合仪器范围(＜4%)，其结果见表1。

表1　PLT-I、PLT-O和PLT-F法批内精密度结果(x-±s)

2.3 批间精密度结果

连续20 d，每日同一时间段测定全血质控品，测试计算结果显示，PLT-I、PLT-O和PLT-F的3种检测方法的批间精密度分别为2.56%、2.14%和1.93%，符合仪器精密度宣称范围(＜4%)。

2.4 携带污染试验结果

进行10组血小板高、低值样本携带污染实验，检测计算结果显示，PLT-I、PLT-O和PLT-F的3种检测方法的平均携带污染率分别为0.78、0.60和0.48，符合仪器精密度宣称范围(＜1%)。

2.5 线性稀释试验

在PLT的3个浓度范围内，PLT-I、PLT-O和PLT-F的3种检测方法检测结果与理论值之间均有良好的相关性，其结果见表2。

表2　PLT-I、PLT-O和PLT-F法线性稀释实验

2.6 红细胞碎片干扰试验

本研究共进行10组高浓度和低浓度RBC碎片干扰实验，3种检测方法的RBC碎片干扰组分别与对照组进行配对t检验，其结果见表3。

表3　PLT-I、PLT-O和PLT-F检测法红细胞碎片干扰实验(x-±s)

表3显示，PLT-I方法高浓度和低浓度RBC碎片组测定值与对照组之间的差异具有统计学意义(t=2.56，t=3.06；P＜0.05)；而PLT-O和PLT-F则有较强的抗RBC碎片干扰能力。

2.7 与手工法PLT-M相关性评价

随机选取100例血样分别进行PLT-I、PLT-O和PLT-F仪器法以及PLT-M手工法计数，将3种检测方法检测结果分别与PLT-M法进行相关性和线性回归分析。计数范围＜100×109/L血样记为低值血小板组，单独进行回归分析，结果见表4。

表4　3种检测法与PLT-M手工法相关性评价(x-±s)

表4显示，PLT-I、PLT-O和PLT-F的3种检测方法与手工法相关性良好。低值血小板组的r值PLT-F＝0.986＞PLT-O＝0.973＞PLT-I＝0.912，表明血小板计数＜100×109/L时，PLT-F法优于PLT-O法，这两种方法明显优于PLT-I法。

3　讨论

血小板由骨髓造血组织中的巨核细胞分化产生，具有维持血管内皮完整性以及粘附、聚集、释放、促凝和血管收缩等功能。血小板计数是临床止血和凝血检查最常用的筛查实验之一，其对出血性疾病、放射治疗及化疗患者的疗效监测具有重要参考价值，也是血液系统疾病诊断的重要指标之一[4]。

目前，计数血小板的方法主要有3类：①显微镜目视计数法。采用草酸铵溶液作溶血稀释液，在相差显微镜下肉眼直接计数血小板。该方法容易受到充池是否均匀、血小板在计数板上的分布等误差因素影响，不同医生之间计数变异系数可达10%～25%之间，已不适用于临床工作的需求[5]；②流式细胞仪法。用荧光标记的血小板抗体CD61/CD41标记血小板，通过流式细胞仪检测荧光计数。流式细胞仪法准确度和精密度极高，是国际血液学标准委员会(ICSH)推荐的参考方法，也是我国卫生行业标准所规定的血小板计数的参考方法[6-7]。但该方法操作复杂、成本昂贵，因此难以在临床上推广使用，一般仅用于方法建立和仪器校准；③全自动血细胞分析仪法。因其具有测定速度快、重复性好及准确度高，能同时提供多项指标，是目前常规筛查PLT的主要方法[8]。

大部分全自动血细胞分析仪血小板计数原理是PLT-I，即在同一通道中通过颗粒大小来鉴别红细胞与血小板，PLT-I法每次可检测20～25万个细胞，理论上具有较好的准确性和重复性。然而，PLT-I法仅通过颗粒体积大小来识别检测血小板，易受非血小板颗粒(nonplatelet particles，NPPs)，如小红细胞、红细胞碎片、白细胞碎片、细菌和真菌以及免疫复合物等干扰[9]。为了提高血小板计数的准确性，增强对NPPs的辨识能力，国内外各大血液分析仪厂商纷纷推出新的血小板计数方法，目前最具代表性的血小板光学计数法有[10]：①以西门子ADVIA®2120血液分析仪为代表的二维激光光散射计数法，此法主要检测原理是当血小板经过检测区时，利用测量双角度检测器接受激光光束照射细胞而产生散射光信号，低角度散射光(2～3o)用于测量细胞体积；高角度(5～15o)散射光测量血小板细胞的折射指数。二维激光光散射计数法能有效的鉴别某些NPPs，如红细胞碎片和小红细胞与血小板体积相似，但折射指数较大，在血小板散点图上分布在右下角，鬼影红细胞由于折射指数较小，则分布在左上角。然而，二维激光光散射计数法仍是单纯利用PLT的物理特性进行检测，其检测灵敏度和准确度均存在一定的局限[11]；②以Sysmex XE 2100血液分析仪为代表的荧光光学血小板计数法，此法采用聚次甲基等核酸染料对血小板的RNA/DNA进行染色，在前向散射光-荧光强度的二维散点图上，对血小板进行检测计数，同时还可以提供未成熟血小板比率(IPF)等参数。此法对上述NPPs具有较强的抗干扰能力，且对低值血小板计数(100×109/L)检测的可靠性更高[12]。

XN系列是Sysmex公司最新推出的多参数全自动血液体液分析仪，采用了多种创新手段，增加了血细胞计数精度，改进了细胞分类和异常细胞识别报警能力[13]。PLT-F是XN系列血液体液分析仪新增的用于血小板计数的独立检测通道，应用了新型核酸荧光染料，使得血小板细胞在前向散射光和(或)荧光强度的二维散点图上更容易与其他细胞区分开。同时PLT-F法采用的5倍粒子计数量也在一定程度上提高了低值血小板计数的精度[14-15]。

本研究中PLT-I、PLT-O和PLT-F检测方法精密度指标：总重复性、批内和批间精密度变异系数均＜4%，满足仪器宣称水平；3种检测方法平均携带污染率分别为0.78、0.60和0.48，均＜1%，也符合厂商宣称水平；线性稀释实验表明，在一定范围内，PLT-I、PLT-O和PLT-F检测方法的3种检测值与理论值之间有良好的相关性，在低值PLT时，PLT-O和PLT-F法与理论值之间拟合性较PLT-I法好；红细胞碎片干扰实验表明，PLT-O和PLT-F法具有相似的抗RBC碎片能力，明显优于PLT-I法；在相关性评价实验中，低值血小板组(＜100×109/L)，3种检测方法与手工法的相关系数rPLT-F＞rPLT-O＞rPLT-I，表明低值血小板计数时，PLT-F法优于PLT-O法，这两种方法明显优于PLT-I法[16-17]。

4　结语

本研究结果表明，PLT-F计数法基本性能优良，能够满足临床检验需求。线性稀释实验和相关性评价结果均表明，在进行低值血小板计数时，与PLT-I和PLT-O法相比，PLT-F法的准确性更高。虽然PLT-F法在血小板计数方面性能优异，但由于其需要消耗额外的荧光染料，检测成本高，检测速度慢(68样本/h)，并不适合日常临床筛查。本研究在个性化定制XN3000流水线时，充分利用了其自动复检功能，自定义复检规则，将第一台XN10设置为主检测机型，采用CBC+DIFF模式(PLT-I法)进行大规模常规筛查，将第二台XN10设置为复检机型。当PLT检测结果触发相应复检规则时，通过轨道自动将相应血样导入第二台XN10血液分析仪采用CBC+DIFF+PLT-F模式(PLT-F法)进行复查。通过2台血细胞分析仪的合理搭配，可有效降低工作量，且能够为临床诊断和治疗提供更准确的信息[18-19]。

参考文献

[1]胡丽涛,王薇,王治国.血液分析仪的方法确认和性能验证[J].检验医学与临床,2011,32(13):2727-2729.

[2]叶应妩,王毓三,申子瑜.全国临床检验操作规程[M].3 版.南京:东南大学出版社,2006:22-23.

[3]Ye Yingwu,Wang Yusan,Shen Ziyu.National Guide to Clinical Laboratory Procedures[M]. Third Edition.Nanjing:Southeast University Press,2006:22-23.

[4]李红林,王庆伟,陆银宝,等.Excel在血细胞分析仪总重复性评价中的应用[J].现代检验医学杂志, 2009,24(5):28-29.

[5]刘成玉,罗春丽.临床检验基础[M].5版.北京:人民卫生出版社,2012:67-69.

[6]Liu Chengyu,Luo Chunli.Basic Clinical Laboratory Medicine [M].Fifth EditionBeijing:People's Medical Publishing House,2012:67-69.

[7]Harrion P,Horton A,Grant D,et al.Immunoplatelet counting:a proposed new reference procedure[J].Br J Haematol,2000,108(2):228-235.

[8]Harrion P,Ault KA,Chapman S,et al.An interlaboratory study of a candidate reference method for platelet counting[J].Am J Clin Pathol,2001,115(3):448-459.

[9]International Council for Standardization in Haematology Expert Panel on Cytometry; International Society of Laboratory Hematology Task Force on Platelet Counting.Platelet counting by the RBC/platelet ratio method a reference method[J].Am J Clin Pathol,2001,115(3):460-464.

[10]Briggs C.Quality counts:new parameters in blood cell counting[J].Int J Lab Hematol,2009, 31(3):277-297.

[11]Dadu T,Sehgal K,Shaikh A,et al.Comparison of platelet counts by sysmex XE 2100 and LH-750 with the international flow reference method in thrombocytopenic patients[J].Indian J Pathol Microbiol,2013,56(2):114-119.

[12]丛玉隆,乐家新,袁家颖.实用血细胞分析技术与临床[M].北京:人民军医出版社,2011:304-306,375.

[13]Cong Yulong,Yue Jiaxin,Yuan Jiaying.Pratical Hematology Analysis Technology and Clinical Application[M].Beijing:People's MilitaryMedical Press,2011:304-306,375.

[14]Bauer N,Nakagawa J,Dunker C,et al.Evaluation of the automated hematology analyzer Sysmex XT-2000iV™compared to the ADVIA®2120 for its use in dogs,cats,and horses:Part I--precision,linearity,and accuracy of complete blood cell count[J].J Vet Diagn Invest,2011,23(6): 1168-1180.

[15]吴敏,文艳,刘爱胜,等.Sysmex XN-9000血液分析仪检测低值血小板的性能评价[J].中国医学装备, 2015,12(8):51-53.

[16]Marionneaux S,Francisco N,Chan V,et al. Comparison of automated platelet counts and potential effect on transfusion decisions in cancer patients[J].Am J Clin Pathol,2013,140(5):747-754.

[17]Briggs C,Longair I,Kumar P,et al.Performance evaluation of the Sysmex hematology XN modular system[J].J Clin Pathol,2012,65(11): 1024-1030.

[18]Tanaka Y,Tanaka Y,Gondo K,et al.Performance evaluation of platelet counting by novel fluorescent dye staining in the XN-series automated hematology analyzers [J].J Clin Lab Anal,2014,28(5):341-348.

[19]魏峰,潘扬.国际血液分析仪41条复检规则的临床应用评价及实验室复检标准的建立[J].检验医学与临床, 2011,8(22):2727-2729.

Research on performance evaluation of new fluorescence platelet count method of hematology analyzer/CUI Xiao-yang, FENG Chun-yan, ZHU Cai-yun, et al// China Medical Equipment,2016,13(1):70-74.

[Abstract]Objective: To evaluate the platelet (PLT) count performance of Sysmex XN 3000 automatic hematology analyzer. Methods: PLT was counted by Sysmex XN 3000 automatic hematology analyzer with electric impedance (PLT-I), optical (PLT-O) and fluorescence (PLT-F) method to test the precision, linear range, carryover and the red blood cell fragment interference. The count results of PLT-I, PLT-O and PLT-F were compared with those of microscopic count method (PLT-M) respectively. Results: The within batch precision of PLT-F was 1.36%and the between batch precision was 1.93%. The ranges of carryover ratio are from 0 to 0.97%with PLT-F, and the average carryover ratio was 0.48%. The correlation coefficient (r) was 0.999 in lower, medium and high value specimens. The result showed that the PLT-F method had great ability of anti-interference in RBC fragment interference experiment. There was significant correlation in the results between PLT-F and PLT-M, and the accuracy of PLT-F was higher especially in low PLT specimens group (rPLT-F>rPLT-O>rPLT-I). Conclusion: The measuring item is of high accuracy, good repeatability, quickness and anti- interference for platelet count. When specimens are hemolysis or the PLT count abnormalities, PLT-F or microscopic method are recommend to review the result.

[Key words]Automatic hematology analyzer; Platelet count; Performance evaluation

收稿日期：2015-03-18

DOI:10.3969/J.ISSN.1672-8270.2016.01.022

[文章编号]1672-8270(2016)01-0070-05

[中图分类号]R446.111

[文献标识码]A

作者简介
崔晓阳,女,(1981- ),硕士，主管检验师。深圳市龙华新区人民医院检验科，从事血液学临床检验工作。