内皮祖细胞与骨折愈合

林上进　程群

200040　上海，　　复旦大学附属华东医院骨科



内皮祖细胞与骨折愈合

林上进程群

200040上海，复旦大学附属华东医院骨科

摘要内皮祖细胞具有参与血管再生和修复的功能，以及分化为血管内皮细胞和成骨细胞的潜能，在血管再生和新骨形成方面起到关键作用。骨折时，内皮祖细胞被动员从骨髓迁移至外周循环来促进骨折愈合。内皮祖细胞的移植治疗开辟了骨折不愈合新的治疗途径。该文就内皮祖细胞与骨折愈合作一综述。

关键词内皮祖细胞；血管发生；新骨形成；骨折愈合

众所周知，骨组织内的脉管系统对骨组织重塑、骨生成及稳态平衡有着不可或缺的作用。新的血管发生不仅对成骨有促进作用，而且对骨折后骨的修复起着关键作用，且血管的发生先于新骨形成[1]。骨折愈合是一个快速和有效的过程，它通过形成骨痂来填补骨折的裂缝和缺口，但有5%～10%的骨折患者愈合失败，从而导致延迟愈合或永久不愈合。同时骨折愈合也是一个复杂而连续的过程，不仅涉及新骨形成，还存在新生血管再生过程。严重移位的粉碎性骨折会大大破坏骨折部位骨组织血管及其血供，从而增加骨折不愈合的风险[2]。在众多骨折不愈合因素中，新生血管数量及功能不足是影响骨痂形成和骨痂骨重建最关键的因素之一。而内皮祖细胞(EPC)是从骨髓释放到外周血循环且具有多种分化潜能如分化成血管内皮细胞、成骨细胞和造血细胞，从而参与骨折部位新生血管生成和新骨形成的一类细胞[3]。本文就EPC与骨折愈合作一综述。

1EPC概述

Asahara等于1997年将体外培养的CD34+EPC成功分化成血管内皮细胞，这一发现为血管再生和修复机制提供新的解释，且提示EPC可能参与血管修复[4]。

1.1分化为血管内皮细胞参与血管再生

EPC能在骨髓和外周循环中被发现，主要分布于骨髓中，外周血中数量较少，在骨髓中的EPC称为骨髓内皮祖细胞(BM-EPC)，在外周循环的EPC称为循环内皮祖细胞(cEPC)，cEPC是BM-EPC从骨髓迁移至外周循环而来，它们具有分化为成熟血管内皮细胞的潜能。前期研究发现，当组织缺血或创伤时，机体通过释放细胞因子和趋化因子等动员EPC从骨髓迁移到外周血，进而迁移到缺血部位且分化为成熟血管内皮细胞参与新生血管建立。同理，骨折时EPC从骨髓迁移至外周循环，进而迁移至骨折部位以提高该组织的血管再生能力、新生毛细血管密度并促进新骨形成，从而促使骨折愈合[5]。 Laing等[6]研究发现，当人体发生创伤导致组织缺血时，cEPC的数量较正常时增高，提示当机体出现组织缺血或血管受损时，EPC作为一种新型的血管内皮前体细胞从骨髓释放至外周循环是对组织创伤的一种代偿反应。Yao等[7]向心肌梗塞小鼠模型注射标记SPIO的EPC，经MRI检查发现这些标记的EPC聚集在心肌梗塞缺血区域，这进一步证实EPC具有向缺血部位迁移并分化成血管内皮的潜能。关于机体促使EPC从骨髓迁移至组织缺血部位及分化为血管内皮细胞的病理生理机制尚未完全明确，但目前多数研究认为组织损伤释放的炎性因子、趋化因子、细胞因子及蛋白水解酶等可能与EPC释放和迁移有关。Shen等[8]研究认为，白细胞介素(IL)-8可能是促使EPC迁移至组织缺血部位的重要因子。Huang 等[9]的体外实验发现，蛋白激酶B(AKT)信号转导通路对于EPC的迁移、增殖及分化起着不可缺少的作用。Cheng等[10]研究发现，EPC通过在心肌缺血区域高表达血管内皮生长因子(VEGF)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)-2、磷酸化蛋白激酶B(pAKT)、一氧化氮(NO)等介质来促进血管再生和血管修复。

1.2分化为成骨细胞参与新骨形成

EPC不仅具有分化成血管内皮细胞的功能，而且还可能具有分化为成骨细胞的能力。Bick等[11]在体外实验中成功将cEPC培育分化为成骨细胞，提示EPC可能具有分化为成骨细胞的潜能。 Ford等[12]研究发现，骨折部位周围存在一些成骨细胞能表达与EPC相同的表面标志物CD34。Gossl等[13]研究发现，冠状动脉粥样硬化患者血循环中表达骨相关蛋白和骨钙素的EPC比例较正常人高，且在早期动脉粥样硬化患者冠状循环中还能检测到表达骨钙素的EPC。Zampetaki等[14]研究发现，EPC从骨髓被动员进入外周循环至血管损伤部位参与血管修复过程中，作为血管内皮前体细胞对骨代谢和血管内皮系统产生了影响。Pirro等[15]研究发现，在绝经后女性体内表达骨钙素或碱性磷酸酶的CD34+细胞数量与机体内骨转化率呈正相关。Peris等[16]研究认为，EPC表达这些骨相关蛋白可能会促使血管钙化诱发动脉粥样硬化而不仅是参与血管修复或再生。此外，Flammer等[17]研究发现在高水平糖化血红蛋白的糖尿病患者体内可检测到高浓度的共表达骨钙素蛋白的EPC，这也间接表明EPC具有分化成成骨细胞的潜能并能表达成骨相关蛋白。

1.3分期

EPC包含早期EPC和晚期EPC两个亚群，每个亚群的表面标志物不相同。早期EPC不成熟，可表达造血干细胞标志物CD133和CD34，进入分化阶段后，造血干细胞标志物逐渐消失，开始表达内皮细胞标志物如血管内皮钙黏蛋白(VE-cadherin)、血管性血友病因子(vWF)、CD31和一氧化氮合酶，分化成为晚期EPC[18]。目前认为早期EPC为CD133+/CD34+/VEGFR-2+，而晚期EPC为CD34+/VEGFR-2+/CD31+/VE-cadherin+/vWF+，明显失去CD133，并开始表达vWF。但大多数研究表明，EPC的常用特征性表面标志为CD34、CD133及VEGFR-2。CD34是Ⅰ型跨膜糖蛋白，表达于造血干细胞、造血祖细胞、胚胎纤维母细胞及血管内皮细胞表面。CD133是一种5次跨膜的细胞表面分子，表达于骨髓和外周血造血干细胞及EPC表面，是区分EPC与成熟内皮细胞的主要指标。VEGFR-2是一种酪氨酸激酶受体，分布于成熟内皮细胞及EPC表面[19]。因此，目前研究EPC的分离和鉴定主要通过免疫检测CD34、CD133及VEGFR-2表达情况。此外，EPC在不同发展阶段所具备的作用也不相同。晚期EPC较早期EPC更具有增殖分化能力，而早期EPC则在主动分泌血管生长因子等旁分泌作用方面更甚一筹[16]。Minami 等[20]根据培养时间长短对EPC进行分期，将培养基培养3～7 d的EPC定义为早期EPC，培养10～16 d的EPC为中期EPC，培养17～23 d的EPC为晚期EPC，培养24～30 d的EPC为超晚期EPC，发现晚期EPC增殖分化能力和集落形成能力最强。

1.4影响因素

EPC既是血管内皮细胞前体细胞，也是成骨细胞和造血细胞前体细胞，是具有游走迁移性、增殖分化及自我更新的定向干细胞，任何影响其凋亡、增殖、归巢、分化等生理活动的因素或病理状态均可使外周循环EPC数量减少，进而影响血管再生和新骨形成。Toupadakis等[21]研究发现，AMD3100作为趋化因子受体-4(CXCR4)拮抗剂通过抑制基质细胞衍生因子-1(SDF-1)/CXCR4轴作用来动员EPC从骨髓向外周循环释放，从而增加cEPC的数量。Huang等[9]研究发现，每日摄入适量红酒可提高cEPC水平及改变NO生物利用度而提高EPC功能，从而减少冠心病发病率。Antonio等[22]研究发现，糖尿病患者cEPC水平较正常人明显下降，表明高血糖状态会减少cEPC数量并影响其功能，这是糖尿病患者发生心血管并发症的可能发病机制之一。Silva等[23]报道，长而持久的运动会增加外周循环VEGF释放以促进cEPC数量并提高其增殖分化为血管内皮的能力。

2EPC在骨折愈合中的作用机制

骨组织是一种含有丰富血管的组织，它的生长、重塑及修复过程需要血管内皮细胞和骨细胞存在紧密的时间和空间联系，故影响骨折愈合的主要因素是血供不足及血管-骨偶联过程受到破坏[24]。对于骨折不愈合或延迟愈合的患者，带血管蒂自体骨移植或异体骨移植被认为是唯一能够解决骨不连部位血供问题的传统方法，但带血管蒂骨移植手术要求术者具备熟练的显微血管外科技术和超长时间的手术操作毅力，此外自体骨移植也有一定的失败率及移植后并发症发生率，其主要原因是由于移植骨血管再生困难导致的血供不足[25]。而骨组织工程学和细胞治疗学在过去10年内的迅速发展给骨折不愈合治疗带来了新希望，EPC作为一种新的内皮细胞来源，参与组织缺血后血管再生、血管内皮修复及组织血循环复苏，在再生医学领域上应用较多[26]。

当机体发生骨折导致血管损伤并破坏骨组织的血供及骨的完整性时，骨折部位向血循环释放炎性因子、细胞因子等炎症介质，细胞因子动员骨髓中的EPC向外周循环迁移，且靶向到达缺血部位，从而参与骨折部位骨生成和血管生成，最终尽快恢复骨折部位血供和促进骨折愈合[24]。近期研究[27]发现，骨折患者外周循环内cEPC数量在骨折24 h后升高，3 d后达到高峰，较正常人cEPC数量明显增多，且差异具有统计学意义。这也支持骨折可以诱发机体动员EPC从骨髓迁移至外周循环，最终到达骨折部位参与骨折愈合修复的结论。EPC参与骨生成、血管生成的病理生理机制和动力学机制，目前尚未明确。它促进骨折愈合的可能机制有2种：①EPC具有分化为血管内皮细胞和成骨细胞的潜能，为两种细胞的前体细胞。大量研究表明，表达CD34的EPC在体外能分化成成骨细胞[13]和血管内皮细胞[28-30]以促进骨折部位新骨形成和新生血管形成。有学者[2]为证明这一假设,经静脉注射免疫标记的CD34+细胞至骨折动物模型内，发现这些细胞被靶向迁移至骨折部位且2周后表达出与人类特有的内皮细胞和成骨细胞相同的细胞表面标志物。②EPC通过旁分泌机制分泌VEGF来促进血管内皮生成和新生骨形成。Kuroda等[31]研究发现，静脉注射VEGF拮抗剂组骨折部位血管内皮细胞和成骨细胞数量较未注射组明显减少，两者差异具有统计学意义。Li等[32]研究发现，将带有VEGF基因的纤维母细胞移植至兔骨折模型可明显促进骨折愈合。Pufe等[33]研究发现，骨折愈合早期VEGF对骨折愈合起非常重要的作用，且VEGF的峰值在骨折5 d后开始逐渐下降。Li等[34]移植EPC支架至大鼠骨折部位来促进骨折愈合，结果发现骨折部位VEGF基因表达明显升高。骨折引起的缺血和VEGF释放可促进新生毛细血管内皮细胞分泌骨形态发生蛋白(BMP)-2和上调BMP-2 mRNA表达，BMP-2作为成骨因子对新生骨形成起直接促进作用[35]。因此，当骨折发生时EPC在骨折部位释放的炎性因子、细胞因子、趋化因子等介导下从骨髓迁移至外周血循环，再被靶向招募至骨折部位，然后EPC分化成血管内皮细胞和成骨细胞并释放VEGF，从而为骨折愈合和血流恢复提供最适宜的微环境。

3 EPC在骨折愈合中的应用

EPC作为新生血管内皮细胞的祖细胞，能对缺血组织进行反应并在第一时间进入缺血部位以刺激新生血管形成和修复损伤组织，它还具有分化成血管内皮细胞和成骨细胞的潜能，以及快速增殖的能力。但EPC对骨折愈合的治疗目前主要处于临床前研究阶段，临床应用至今报道较少。

EPC移植治疗研究主要可分为2个阶段：①经静脉注射进行EPC移植治疗来观察血管损伤修复的效果，主要应用在心血管系统疾病治疗方面。Fang等[36]通过兔子耳缘静脉注射体外扩增的自体EPC来促进动脉瘤修复和内皮增生。Iwasaki等[37]通过静脉注射人EPC促进大鼠心肌和血管再生来恢复心肌泵血功能。Matsumoto等[38]通过静脉注射人EPC来促进坏死骨组织的血管修复和新生血管形成，进而促进骨折愈合。②通过生物载体进行EPC局部移植来促进骨折愈合效果，主要应用于骨折愈合或创伤骨科方面。鉴于静脉注射EPC是全身性反应，移植的EPC不仅能有效促进骨折愈合，而且这些细胞还会迁移至其他组织和器官如肺、肝、胸腺、脑等，可能在骨外组织产生一些无法预见和控制的远期影响，故目前EPC对骨折愈合影响的研究基本采用局部移植方法。Rozen等[39]在兔骨折模型骨折端之间人为构建一楔形纤维窦道，移植预先在体外扩增的EPC至该纤维窦道中，经显微CT检查发现EPC局部移植能在骨折缺损处促进形成大量致密的编织骨以达到骨折愈合。Atesok等[40]在大鼠股骨骨折模型中运用无菌明胶海绵载体局部移植EPC，发现EPC移植治疗组骨折全部愈合，而对照组骨折全部不愈合。Li等[2]利用明胶海绵为载体局部移植EPC治疗大鼠股骨骨折，发现局部EPC移植治疗不仅能促进骨折愈合，还能提高骨的微结构和生物力学稳定性。以上研究均提示，EPC对于骨折尤其是骨折延迟愈合、骨折不愈合和骨组织缺损患者有潜在而明显的治疗效果。基于以上研究，Kuroda等[41]首次进行运用自体EPC治疗骨折不愈合的病例报道，他们运用胶原蛋白支架来承载粒细胞集落刺激因子(G-CSF)动员的自体EPC并采用髂前上棘进行自体骨移植，将支架移植至胫骨不愈合断端，结果显示患者术后无严重不良事件发生，且在术后9个月骨折成功愈合。随后Kuroda等[42]又运用胶原蛋白支架承载G-CSF动员的自体EPC移植治疗7例骨折不愈合，术后随访1年，结果无不良及严重并发症出现，且术后12周5例(71.4%)达到影像学骨折愈合，远远超过根据历史资料制定的预先设定阈值(18.1%)。随着临床Ⅰ/Ⅱa期实验的进行，EPC移植治疗在人体实验中获得较大的成就，且获得和分离创伤小、安全、有效，不像骨髓间质干细胞只能麻醉下通过手术从骨髓中提取[43]，这些都对EPC 在骨折不愈合中的应用具有巨大的推动作用。

动物实验和有限的体内研究显示，EPC能明显促进新生血管生成和新生骨形成，提高骨折愈合能力。但血管形成与骨发生在空间和时序上有怎样的联系；它们对骨转换和破骨细胞的功能作用如何；既然EPC具有分化为成骨细胞的潜能，那么EPC在骨质疏松性骨折，甚至预防和治疗成骨功能低下引起的骨质疏松症方面是否也同样有效，这需要对EPC促进骨折愈合的分子生物学机制进一步理解和探索。相信在不久的将来，体外扩增的自体EPC移植治疗将会成为骨折不愈合的重要治疗策略。

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(收稿：2015-04-29; 修回：2015-11-30)

(本文编辑：卢千语)

DOI：10.3969/j.issn.1673-7083.2016.01.008

通信作者：程群E-mail: quncheng_2014@163.com

基金项目：国家自然科学基金(81471089)、上海市卫生系统重要疾病联合攻关项目(2013ZYJB0801)