代谢组学在HBV相关肝脏疾病中的研究进展

纪留娟　钱志平　王介非



·综述·

代谢组学在HBV相关肝脏疾病中的研究进展

纪留娟钱志平王介非

乙型肝炎病毒感染呈世界性分布，病程迁延不愈可发展为慢性肝炎、肝纤维化、肝硬化和肝细胞癌(HCC)，部分患者病情恶化可进展为肝功能衰竭[1]。肝脏作为人体最重要的代谢器官，一旦发生疾病必然引起相关的代谢网络发生变化，进而影响到体内众多的内源性小分子代谢物水平。检测体液中的这些内源性小分子物质可作为肝脏损伤的敏感指标并且有助于分析和阐明肝脏疾病的病因学和发病机制[2]。系统生物学的分支—代谢组学可实现这一目标。本文就代谢组学在HBV相关肝脏疾病中近几年的研究进展进行如下综述。

一、代谢组学概述

(一)代谢组学含义代谢组学是继基因组学、蛋白质组学、转录组学后出现的以定量描述生物体内代谢物多参数变化为目标的新兴“组学”[3]。1999年Nicholson等[4]正式提出代谢组学的概念：可以定量测定生物体系对病理生理刺激或遗传因素改变所产生的动态多参数代谢应答的一种方法。它所关注的是代谢路径中相对分子质量在1000以内的小分子物质，反映外界刺激或遗传修饰下细胞或组织的代谢应答变化[5]。著名学者German等[6]曾在他的文章中写到: “基因组学反映了什么是可以发生的，转录组学反映的是将要发生的，蛋白质组学指出了什么是赖以发生的，只有代谢组学才真正反映已经发生的。” 代谢组学的优势在于其研究的是生物体中小分子物质产生和代谢的最终结果, 而基因组、蛋白质组则具有累加性和补偿作用, 他们有效的微小变化都会在代谢物上得到放大。因此,代谢物的识别更容易、更能准确地反映生物体系的状态。

(二)代谢组学的研究方法根据研究对象和目的不同，Fiehn等[7]将代谢产物分析分为代谢物靶标分析、代谢轮廓分析、代谢组学及代谢指纹分析4个层次。严格地说，只有第三层次才是严格意义上的代谢组学研究。

目前，代谢组学分析平台主要有液相色谱与质谱联用技术(LC-MS) 、气相色谱与质谱联用技术(GC-MS) 、核磁共振技术( NMR) 3 种。它们各有优缺点：LC-MS技术对待测组分的挥发性和热稳定性没有要求，前期处理简单，可进行快速高效的检测，但缺少可以参考的标准谱库，代谢物鉴定需借助标准品，鉴别相对困难； GC-MS 技术具有较高的分辨率和检测灵敏度，并且有可供参考的标准谱图库，可用于代谢产物定性，但是对于挥发性低的样品需做衍生化处理，前期处理复杂繁琐且可能会导致某些物质信号的丢失；NMR分为氢谱(1H-NMR)、碳谱(13C-NMR)和磷谱(31P-NMR)。NMR技术样品前处理简单，对样品中小分子代谢物的结构和性质无破坏性，因此可较全面地分析样本成分，不具有偏向性，但其灵敏度较低，难以准确地进行定量分析，不大适用于大量低丰度代谢物的分析。由于代谢物的多样性与复杂性，目前并没有一个单一的技术可以同时测定和识别样品中所有的代谢物，所以需综合各分析平台的数据以得到更全面的代谢物信息。

应用生物分析技术获得原始数据后，需要应用一系列的化学计量学方法对其进行分析，目前最常用的模式识别方法包括主成分分析(PCA)、分层聚类分析( HCA)等无监督模式识别方法和正交偏最小二乘法(0PLS)，偏最小二乘法-判别分析(PLS-DA)、随机森林分析(RF)等有监督模式识别方法。其中，PCA、PLS-DA、 OPLS-DA 使用最广泛。

迄今为止，国内外已有许多学者对HBV相关肝炎、肝硬化、肝细胞癌(HCC)和肝衰竭患者开展代谢组学研究，以便能更全面了解HBV相关肝脏疾病发生、发展过程中的物质变化规律。

二、代谢组学在HBV相关肝脏疾病研究中的应用

(一)代谢组学在慢性乙型肝炎、肝硬化、肝细胞癌中的应用

1. 慢性乙型肝炎HBV在我国流行已超过半个世纪，因早年缺乏抗病毒药物，故当前临床所遇到的许多病例已由乙肝病毒携带者进展为慢性乙型肝炎、肝纤维化、肝硬化和肝细胞癌。侯玉洁等[8]对慢性乙型肝炎患者、健康对照者血清进行代谢组学分析，发现柠檬酸、乌头酸、谷氨酰胺、N，N-二甲基甘氨酸、丙二酸可作为区分慢性乙型肝炎患者和正常人的潜在标志物，这些差异代谢物涉及慢性乙型肝炎患者体内糖、氨基酸及脂类三大物质代谢异常，与免疫功能及体内有氧呼吸代谢过程有密切关系。Zhang等[9]对慢性乙型肝炎患者、健康对照者尿液标本进行代谢组学分析，发现生物素砜、5-氧代二十一烷酸、d-葡糖胺、2-甲基庚酸在慢性乙型肝炎组和健康对照组尿液中存在明显差异。推测这些差异代谢物与乙型肝炎病毒干扰细胞色素P450、苯丙氨酸、氨基糖及核苷酸糖等的代谢通路相关。Gao等[10]发现苯基丙氨酸、苹果酸、5-甲氧色胺可准确地将慢性乙型肝炎组与健康对照组归类。Shao等[11]对慢性乙型肝炎感染不同阶段的血清进行代谢轮廓分析，发现甘氨胆酸、牛磺胆酸、牛磺鹅脱氧胆酸、胆绿素、羰基癸烯酸和溶血磷脂酰胆碱是免疫清除期特异的临床指标，它们对于判断CHB患者是否处于免疫清除期有较高的敏感性和特异性。而油酰胺可作为非活动期的生物标志物。这些潜在的生物标志物在肝细胞的损伤和修复，能量代谢，脂肪酸和胆汁酸的生物合成和炎症的进展过程中发挥着重要作用，它们有望代替肝组织活检用于鉴别CHB处于何种临床分期的判断，可为判断慢性乙型肝炎感染免疫清除期提供新的诊断标志物，对指导抗病毒治疗具有十分重要的意义。

2. 慢性乙型肝炎相关肝硬化肝硬化患者往往由于肝功能失代偿,常存在腹水、上消化道出血等一系列并发症而需要住院治疗,对公共卫生构成了重大威胁。肝硬化的病因种类繁多，有学者尝试利用代谢组学方法进行病因区分。Qi等[12]采用核磁共振(NMR)方法检测21例乙肝肝硬化患者、20例酒精性肝硬化患者和20例健康对照者的血清代谢物，结果发现肌酸、乙酰乙酸、异丁酸盐、谷氨酰胺和谷氨酸在乙肝肝硬化患者和酒精性肝硬化患者之间存在明显差异，可作为两种疾病诊断的特异性标志物，并为探讨乙肝肝硬化和酒精性肝硬化的发病机理提供了一种新的技术方法。Gao等[10]采用气相色谱飞行时间质谱(GC-TOF-MS)技术对健康对照组、慢乙肝组、肝硬化组、肝癌组进行血清代谢组学分析，鉴定出包含在氨基酸代谢、能量代谢及柠檬酸循环等关键性的代谢通路当中的15种血清代谢物。经进一步验证发现棕榈酸在慢乙肝组和肝硬化组存在明显差异，天冬酰胺酸、β-谷氨酸盐可准确区分肝硬化组和肝癌组。Mark等[13]纳入失代偿期肝硬化患者80例(62例存活，18例死亡)进行血浆代谢分析，显示非存活组磷脂酰胆碱和脂质减少；乳酸、酪氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸信号增强。磷脂酰胆碱和氨基酸失调与死亡率升高和疾病严重程度相关，血浆代谢分析可准确预测失代偿期肝硬化患者的死亡率。Dabos等[14]发现乙酰乙酸、β-羟丁酸、谷氨酸、乳酸、丙酮酸、苏氨酸、天门冬氨酸在乙肝肝硬化组比正常对照组明显升高，谷氨酰胺、组氨酸、精氨酸则明显降低。推测乙肝肝硬化患者的酮体代谢、尿素循环及糖异生存在明显障碍。

3. 慢性乙型肝炎相关肝细胞癌HCC的发生是一个渐进的过程，常隐匿起病，出现临床症状往往已到晚期，死亡率极高，因而如何早发现、早诊断、早治疗已成为肝癌研究的重点。AFP在临床上应用最广，但其检测灵敏度还不到70%且不具有特异性，因此，急需寻找新的特异标志物用于HCC的早期诊断、病情监测和预后判断[15]。Liu等[16]对HBV相关HCC患者的肿瘤标本匀浆液进行检测，发现肿瘤中央组织和远癌组织中14 个代谢物差异显著，其中包括9个已经报道的代谢物[17, 18]和5个未曾报道的代谢物(β-谷甾醇、喹哪啶酸、花生肉碱、肉豆蔻醛和油酸酰胺)。推测这些代谢物与远癌组织向中央癌组织的发展变化过程有关并为抗癌研究提供了新的靶标。Wang等[19]发现刀豆氨酸琥珀酸在乙肝肝硬化患者中显著降低而在HCC患者中是明显升高的，可作为区分肝癌与肝硬化患者的诊断指标；甘氨鹅脱氧胆酸可作为在HBV相关HCC的早期诊断及疾病治疗监测的特征性生物标志物。Lu等[20]发现HCC组中脂肪酸、长链酰基肉碱明显升高，碳水化合物、氨基酸、短中链酰基肉碱含量明显高于健康对照组。精氨酸联合棕榈酰肉碱诊断乙肝相关肝细胞癌的敏感性和特异性分别高达97.3%和100%。Li等[21]对乙型肝炎病毒感染的肝细胞癌宿主细胞HepG2.2.15和HepG2进行代谢组学分析,发现11个代谢物存在显著差异。N-乙酰氨基葡萄糖激酶在HepG2.2.15的表达显著增加,证明己醣胺生物合成途径在乙肝病毒感染细胞中被激活,为未来研究乙型肝炎病毒感染靶向治疗提供了一个新思路。

(二)代谢组学在HBV相关肝衰竭中的应用

肝衰竭是多种因素引起的严重肝脏损害，导致其合成、解毒、排泄和生物转化等功能发生严重障碍或失代偿，出现以凝血功能障碍、黄疸、肝性脑病、腹水等为主要表现的一组临床症候[22]。利用代谢组学的方法来研究肝衰竭患者体液代谢物的变化规律对于肝衰竭早期诊断、阐明肝衰竭发病机制、评估病情严重程度、早期判断患者预后具有重要临床意义。

1. 代谢组学在HBV相关肝衰竭发病机制中的应用肝衰竭的发病机制十分复杂，迄今国内外有很多学者都是从基因水平研究肝衰竭的发病机制。利用代谢组学技术检测肝衰竭动物或患者的代谢物谱能够反映出肝脏以及全身的代谢途径的改变，进而可以从基因产物(各种代谢物质)的水平来阐明机制。Yu等[23]对24例由乙型肝炎病毒引起的急性肝衰竭病人和23例健康对照者进行了血清代谢组学研究,结果发现肝衰竭组氨基酸、葡萄糖表现的色谱图与健康人明显不同。推测是由于正常的肝脏能够合成、储存、分解糖原维持血糖平衡，而肝衰竭患者肝糖原的合成与储存均减少，从而多种糖类浓度下降,因此通过识别氨基酸、葡萄糖色谱图可早期区分肝衰竭患者。研究还发现多种氨基酸浓度升高，支链氨基酸/芳香族氨基酸下降，此结论与以往肝衰竭发病时出现支链氨基酸芳香族氨基酸代谢紊乱的研究结论一致。Amathieu等[24]利用NMR结合OPLS数据分析对30例乙肝肝硬化基础上慢加急性肝衰竭患者(ACLF)和93例慢性肝衰竭患者的血清进行研究。研究发现ACLF组中乳酸、丙酮酸、酮体、谷氨酰胺明显升高，而高密度脂蛋白含量明显低于CLF组。

代谢组学的研究进一步阐明了肝衰竭是一种扰乱糖类、脂类、氨基酸等多种重要代谢途径的复杂综合征。因此代谢组学可以阐述肝衰竭发生发展的病理机制，也可为肝衰竭的早期诊断提供新的方法，同时鉴定了与HBV相关肝衰竭严重程度及预后相关的生物标志物。

2. 代谢组学在HBV相关肝衰竭早期诊断、病情严重程度及预后评估中的应用HBV相关肝衰竭患者的病情凶险，病死率高，对其进行早期诊断、准确评估、及时治疗至关重要。在临床实践中，肝衰竭的诊断基于高胆红素血症和凝血时间的延长，但是以上两个指标不能完全反映肝脏的功能，对肝衰竭的早期诊断具有局限性[25, 26]。基于多变量数据分析的代谢组学在肝衰竭的早期诊断以及发现肝衰竭的诊断标志物方面具有显著优势。MAO等[27]运用气相色谱质谱(GC/MS)技术对24例HBV相关肝衰竭患者和23例健康对照者进行代谢组学研究，研究发现甘油酸、顺式乌头酸、柠檬酸可被鉴定为诊断肝衰竭的潜在生物标志物。提示HBV相关肝衰竭患者的肝细胞线粒体损伤，导致三羧酸循环出现紊乱。Zhang等[28]采用气相色谱质谱(GC/MS)技术结合主成分分析方法(PCA)及质谱多反应监测技术(MRM)对26例HBV相关肝衰竭患者和16例健康志愿者的血清进行代谢物谱分析, 发现主成分分析模型能区分肝衰竭组与健康对照组；同时又对165例患者进行验证，模型预测肝衰竭特异度和敏感度分别高达94.3%和100%。

目前常用CTP评分系统和MELD评分系统对肝衰竭患者的严重程度进行评估，但是以上两种评分系统没有完全考虑到肝衰竭时患者代谢的紊乱，其预测的准确性和操作的简易性尚存在争议，临床运用存在局限性。Nie等[29]发现与慢性乙型肝炎组、乙型肝炎肝硬化组、正常对照组相比，HBV相关慢加急性肝衰竭组中溶血磷脂酸 (P-16:0e/0:0) 、溶血磷脂酸(18:0e/0:0)明显升高，溶血卵磷脂、卵磷脂(20:4(5Z,8Z,11Z,14Z)e/2:0)和卵磷脂(16:0/18:2(9Z,12Z))明显降低。溶血卵磷脂、溶血磷脂酸、磷脂酸含量的变化趋势和肝脏疾病的严重程度是一致的，可以作为预测ACLF 预后的潜在标志物。Amathieu 等[30]应用1H-NMR结合PCA软件对124例HBV相关慢性肝功能衰竭(CLF)患者血清样本进行检测发现多种代谢物在肝衰竭病变程度不同时有显著差异，磷酸胆碱和高密度脂蛋白在重度慢性肝衰竭患者(MELD评分>35分)血清中明显低于轻度慢性肝衰竭患者(MELD评分<6分)，而丙酮酸、乳酸及肌酸明显升高。其中肌酸是机体内能量转移过程中的一个重要成分，现在已经被认为是评估肝脏损伤的一个非常灵敏的指标，可用于对肝衰竭患者肝损伤严重程度的评估[31]。Liu等[32]采用气相色谱质谱结合典型判别分析(CDA)对乙型肝炎肝衰竭进行代谢组学研究，能够将不同严重程度的肝衰竭患者明显区分，从而判断肝衰竭的严重程度，其判断的正确率达到了91．7%，较常规的血清酶学诊断正确率(75%)有明显的提高。

3. 代谢组学在HBV相关肝衰竭并发肝性脑病中的应用

肝性脑病是肝衰竭患者最常见的并发症，也是导致肝衰竭患者死亡的主要原因，目前其发病机制并不十分明确，主要有氨中毒学说、氨基酸代谢异常、假性神经递质形成及氨基丁酸学说等[33, 34]。齐等[35]采用NMR方法对乙型肝炎肝硬化患者和轻微肝性脑病(MHE)患者的血清代谢物进行检测，并用临床标本验证了代谢组模型诊断MHE的可行性。OPLS-DA模型显示:与肝硬化组相比，MHE组患者血清中的谷氨酰胺、苯丙氨酸、丙酮增高，缬氨酸和异亮氨酸降低。谷氨酰胺具有神经毒性，能影响中枢神经系统的兴奋性与能量代谢，也是评估肝性脑病严重程度的一个重要指标。缬氨酸和异亮氨酸浓度降低，苯丙氨酸水平升高，提示肝性脑病时，芳香族氨基酸(AAA)在脑内增加，而支链氨基酸(BCAA)水平降低。Dabos等[14]采用NMR技术对乙型肝炎肝硬化组、肝性脑病组、健康对照组进行代谢组学分析，发现肝性脑病组比正常组亮氨酸明显升高。肝性脑病组谷氨酰胺、甘油、肌醇比肝硬化组明显降低，β-羟丁酸、乙酰乙酸、亮氨酸、异亮氨酸则比肝硬化组明显升高。丙酮[35]、乙酰乙酸、β-羟基丁酸浓度升高说明发生肝性脑病时脑细胞酮体利用发生障碍。代谢组学技术可同时检测患者血清中多种代谢物质，能够提供系统的、完整的代谢物变化情况，有助于从分子水平研究肝性脑病的病理形成机制，可能为肝性脑病的诊断提供一种新的手段。

三、小结与展望

代谢组学的发展已不断的趋于成熟，其相比较于传统的诊断方法及蛋白质组学和基因组学更有优势。该技术只要采集患者的尿液、粪便、血液或组织样本即可进行检测，是一种操作简便、经济成本低、无创的检验方法。代谢组学在HBV相关肝脏疾病的研究中也显示出了巨大的潜力，其已经广泛应用于慢性乙型肝炎，HBV相关肝硬化、肝细胞癌、肝衰竭及肝性脑病等各种肝脏疾病的研究中。但由于代谢组学还处于初步发展阶段，各种分析技术仍需要进一步完善。相信未来伴随着更高通量、高灵敏度检测手段和更高效的数据分析方法的整合应用，以及与基因组学、转录组学、蛋白质组学等各组学技术的联用，其在肝脏疾病的发病机制、早期诊断、疗效评估、预后预测等方面将有更重要的价值。

[1]胡晓丽, 赵宏伟, 吴晓岩, 等.乙型肝炎病毒感染的流行现状. 临床肝胆病杂志, 2012,28:413-416.

[2]Yang J, Xu G, Zheng Y, et al. Diagnosis of liver cancer using HPLC-based metabonomics avoiding false-positive result from hepatitis and hepatocirrhosis diseases.Chromatography B,2004,813:59-65.

[3]Ippolito JE, Xu J, Jain S, et al. An integrated functional genomics and metabolomics approach for defining poor prognosis in human neuroendocrine cancers.Proc Natl Acad Sci USA, 2005,102:9901-9906.

[4]Nicholson JK, Lindon JC, Holmes E, et al. 'Metabonomics': understanding the metabolic responses of living system s to pathophysiological stimuli via multivariate statistical analysis of biological NMR spectroscopic data. Xenobiotica, 1999,29:1181-1189.

[5]Jenkins H, Hardy N, Beckmann M, et al. A proposed framework for the description of plant metabolomics experiments and their results. Nat Biotechnol, 2004,22:1601-1606.

[6]German JB, Bauman DE, Burrin DG, et al. Metabolomics in the opening decade of the 21st century: building the roads to individualized health. J Nutr, 2004,134:2729-2732.

[7]Fiehn O. Metabolomics the link between genotypes and phenotypes. Plant Mol Biol, 2002,48:155-171.

[8]侯玉洁, 祝文君, 陈长功, 等. 基于气相色谱质谱联用技术的乙型肝炎血清代谢标志物的探究. 色谱, 2015,4:383-388.

[9]Zhang A, Sun H, Han Y, et al. Urinary metabolic biomarker and pathway study of hepatitis B virus infected patients based on UPLC-MS system. PLoS One, 2013,8：DOI:10.1371/journal.pone.0064381.

[10]Gao R, Cheng J, Fan C, et al. Serum metabolomics to identify the liver disease-specific biomarkers for the progression of hepatitis to hepatocellular carcinoma. Sci Rep, 2015,5:DOI:10.1038/srep 18175.

[11]Shao X, Niu J. A metabonomics study of chronic hepatitis B in different stages. Gastroenterol Hepatol, 2013, 28:644-644.

[12]Qi S, Tu Z, Ouyang X, et al. Comparison of the metabolic profiling of hepatitis B virus-infected cirrhosis and alcoholic cirrhosis patients by using 1H NMR-based metabonomics. Hepatol Res, 2012,42:677-685.

[13]McPhail MJ, Shawcross DL, Lewis MR, et al. Multivariate metabotyping of plasma predicts survival in patients with decompensated cirrhosis. Hepatology, 2016,64:1058-1067.

[14]Dabos KJ, Parkinson JA, Sadler IH,et al. 1H nuclear magnetic resonance spectroscopy-based metabonomic study in patients with cirrhosis and hepatic encephalopathy. World J Hepatol, 2015,7:1701-1707.

[15]Tsai T, Song E, Zhu R, et al. LC-MS/MS-based serum proteomics for identification of candidate biomarkers for hepatocellular carcinoma. Proteomics, 2015,15:2369-2381.

[16]Liu S, Zhang RL, Kang H, et al. Human liver tissue metabolic profiling research on hepatitis B virus-related hepatocellular carcinoma. World J Gastroenterol, 2013,19:3423-3432.

[17]Tan Y, Yin P, Tang L, et al. Metabolomics study of stepwise hepatocarcinogenesis from the model rats to patients: potential biomarkers effective for small hepatocellular carcinoma diagnosis. Mol Cell Proteomics,2012, 11:DOI:10.1.74/mcp. M111.010694.11

[18]Chen F, Xue J, Zhou L, et al. Identification of serum biomarkers of hepatocarcinoma through liquid chromatography/mass spectrometry-based metabonomic method. Anal Bioanal Chem,2011,401: 1899-1904

[19]Wang B, Chen D, Chen Y, et al. Metabonomic profiles discriminate hepatocellular carcinoma from liver cirrhosis by ultraperformance liquid chromatography-mass spectrometry. J Proteome Res, 2012,11:1217-1227.

[20]Lu YH, Huang C, Gao L, et al. Identification of serum biomarkers associated with hepatitis B virus-related hepatocellular carcinoma and liver cirrhosis using mass-spectrometry-based metabolomics. Metabolomics,2015,11:1526-1538.

[21]Li H, Zhu W, Zhang L, et al. The metabolic responses to hepatitis B virus infection shed new light on pathogenesis and targets for treatment. Scientific Reports, 2015,5:DOI:10.1038/srep08421.

[22]中华医学会感染病学分会肝衰竭与人工肝学组. 肝衰竭诊治指南(2012年版).临床传染病学杂志,2012,5:321-327.

[23]Yu K, Sheng G, Sheng J, et al. A metabonomic investigation on the biochemical perturbation in liver failure patients caused by hepatitis B virus. J Proteome Res, 2007,6:2413-2419.

[24]Amathieu R, Triba MN, Nahon P, et al. Serum 1H-NMR metabolomic fingerprints of acute-on-chronic liver failure in intensive care unit patients with alcoholic cirrhosis. PLoS One, 2014,9:DOI:10.1371/journal.pone.0089230.

[25]Ott M, Cantz T, Schneider A, et al. Diagnostik and behandlung des akuten leberversagens. Der Internist, 2014,55:1288-1295.

[26]Chen E, Zeng F, Zhou L, et al. Early warning and clinical outcome prediction of acute-on- chronic hepatitis B liver failure. World J Gastroenterol, 2015,21:11964-11973.

[27]Mao Y, Huang X, Yu K, et al. Metabonomic analysis of hepatitis B virus-induced liver failure: identification of potential diagnostic biomarkers by fuzzy support vector machine. J Zhejiang Univ Sci B, 2008,9:474-481.

[28]Zhang L, Jia X, Peng X, et al. Development and validation of a liquid chromatography-mass spectrometry metabonomic platform in human plasma of liver failure caused by hepatitis B virus. Acta Biochimica et Biophysica Sinica, 2010,42:688-698.

[29]Nie CY, Han T, Zhang L, et al. Cross-sectional and dynamic change of serum metabolite profiling for hepatitis B-related acute-on-chronic liver failure by UPLC/MS. Journal of Viral Hepatitis, 2014,21:53-63.

[30]Amathieu R, Nahon P, Triba M, et al. Metabolomic approach by 1H NMR spectroscopy of serum for the assessment of chronic liver failure in patients with cirrhosis. J Proteome Res, 2011,10:3239-3245.

[31]Longo N, Ardon O, Vanzo R, et al. Disorders of creatine transport and metabolism. Am J Med Genet C: Seminars in Medical Genetics, 2011,157:72-78.

[32]许彬, 王海龙, 魏开华, 等. 代谢组学分析技术及其在几类重大疾病研究中的应用.分析测试学报, 2006:128-132.

[33]汪茂荣. 《国际肝性脑病和氮质代谢共识》解读:肝硬化患者肝性脑病的营养管理.实用肝脏病杂志, 2013,4:303-305.

[34]Holecek M. Evidence of a vicious cycle in glutamine synthesis and breakdown in pathogenesis of hepatic encephalopathy-therapeutic perspectives. Metab Brain Dis, 2014,29:9-17.

[35]齐素文, 戴勇, 欧阳昕, 等. 轻微肝性脑病患者血清中代谢物组的研究. 第三军医大学学报, 2011,23:2503-2507.

(本文编辑：张苗)

国家十二五科技重大专项(2012ZX10005)

200083上海复旦大学附属公共卫生临床中心重症肝病&ICU科

钱志平，Email: qianzhiping@shaphc.org

2016-05-18)