红丝线药材的HPLC指纹图谱研究Δ

曹庆玺，邓洁媚，姬生国，王 东（广东药科大学中药学院，广州 510006）

红丝线药材的HPLC指纹图谱研究Δ

曹庆玺＊，邓洁媚，姬生国，王 东#（广东药科大学中药学院，广州 510006）

目的：建立红丝线药材的高效液相色谱（HPLC）指纹图谱。方法：采用HPLC法。色谱柱为ODS-C18，流动相为甲醇-水（梯度洗脱），流速为1.0 ml/min，检测波长为370 nm，柱温为30Ⅱ，进样量为20 μl。以2号色谱峰为参照峰，测定11批样品的HPLC图谱，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2004 A版）进行共有峰指认和相似度评价。结果：11批药材样品HPLC图谱有10个共有峰，相似度均≥0.965。经验证，11批样品HPLC图谱与对照图谱具有较好的一致性。结论：该试验所建立的HPLC指纹图谱专属性强、结果稳定，可作为红丝线药材质量评价的主要依据之一。

红丝线；指纹图谱；高效液相色谱法；质量评价

红丝线Lycianthes biflora，又名山蓝、红蓝、观音草，来源于爵床科红丝线草属植物红丝线Peristrophe roxburghiana（Schult.）Brem.的全草，主产于云南、四川南部、广西、广东、江西、福建、台湾等地。作为一种民间草药，其常用于止咳祛痰和治咯血、跌打损伤等症。《常用中草药手册》载：“淡凉，散瘀、止血，治跌打淤肿、急性扭挫伤、内伤咳血”[1]。《全国中草药汇编》载：“甘、淡、凉。清肺止咳，散瘀止血。治肺结核咯血、肺炎、糖尿病、跌打损伤肿痛”[2]。研究表明，红丝线含有可食用的、无毒的天然色素[3-4]，还具有多种活性成分[5]，如生物碱[6]、萜类化合物[7]、有机酸[8]、黄酮类化合物[9]、挥发油[10]、脂肪族化合物及微量元素等[11]；红丝线提取物具有降压[12]、保肝护肝[13]、镇咳止咳[14]、抗氧化[15]等药理作用。但目前市售红丝线药材质量参差不齐，甚有掺假，严重影响了用药的安全性和有效性。本课题组拟通过对红丝线药材的高效液相色谱（HPLC）指纹图谱进行研究，为其质量评价提供依据。

1 材料

1.1 仪器

LC-20AT型HPLC仪（包括SPD-20A二极管阵列检测器）、BP211B型电子天平（日本Shimadzu公司）；HH-4型恒温水浴锅（江苏省金坛市宏华仪器厂）；KQ-500DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，功率：500 W，频率：40 kHz）；RE-2000B型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）。

1.2 试剂

甲醇为色谱纯，乙醇为分析纯，水为重蒸水。

1.3 药材

11批样品（见表1）经广东药学院中药学院姬生国教授鉴定为真品。样品经低温干燥后粉碎过60目筛，保存于密封袋内，置于干燥器中，备用。

表1 红丝线药材来源Tab 1 Source of L.biflora

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：ODS-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇（A）-水（B），梯度洗脱（0～60 min，20%→90%A）；流速：1.0 ml/min；检测波长：370 nm；柱温：30Ⅱ；进样量：20 μl。

2.2 供试品溶液的制备

精密称取样品粉末1 g，置于锥形瓶中，加75%乙醇20 ml，超声处理60 min，冷却至室温，减压抽滤，滤液以旋转蒸发仪蒸干，以5 ml 80%甲醇溶解，经0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验 取“2.2”项下供试品溶液适量，按“2.1”项下色谱条件连续进样测定6次，以2号峰的保留时间和峰面积为参照，记录各共有峰相对保留时间和相对峰面积。结果，各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均＜3%（n＝6），表明方法精密度良好。

2.3.2 稳定性试验 取“2.2”项下供试品溶液（批号：120817J3 02）适量，分别于室温下放置0、2、4、6、8 h时按“2.1”项下色谱条件进样测定，以2号峰的保留时间和峰面积为参照，记录各共有峰相对保留时间和相对峰面积。结果，各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均＜3%（n＝5），表明供试品溶液在室温放置8 h内基本稳定。

2.3.3 重复性试验 精密称取同一批样品（批号：120817J302）适量，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，共6份，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，以2号峰的保留时间和峰面积为参照，记录各共有峰相对保留时间和相对峰面积。结果，各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均＜3%（n＝6），表明本方法重复性良好。

2.4 指纹图谱的建立与对照图谱的生成

2.4.1 指纹图谱的建立 取11批样品适量，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，得特征指纹图谱，详见图1。

图1 11批样品高效液相色谱指纹图谱Fig 1 HPLC chromatograms fingerprint of 11 batches of samples

2.4.2 对照图谱的生成 采用国家药典委员会发布的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2004 A版）对11批样品HPLC图谱进行图谱拟合，生成对照图谱，详见图2。结果表明，11批样品HPLC图谱共有特征峰10个，其中2号色谱峰的峰形好、分离度高、含量高，因此选择作为参照峰。

图2 11批样品高效液相色谱对照图谱Fig 2 HPLC chromatograms control of 11 batches of samples

2.5 相似度分析

采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2004 A版）对11批样品HPLC图谱进行相似度分析，结果见表2。表2显示，11批样品HPLC图谱虽然共有峰面积存在一定的差异，但整体特征相似，其相似度均≥0.965，说明11批样品HPLC图谱与对照图谱具有较好的一致性；不同批次药材虽有差异但仍具有较好的相关性。

表2 11批样品的相似度评价结果Tab 2 Similarity evaluation results of 11 batches of samples

2.6 变质样品的检测

取样品适量，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，共6份，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱并与对照图谱进行叠加对比，详见图3。图3表明，两者图谱差异明显，变质的药材样品HPLC图谱与对照图谱的相似度仅为0.609，远小于规定的0.90。

图3 变质样品与正品的高效液相色谱图A.变质样品；B.变质样品与正品叠加图谱Fig 3 HPLC chromatograms of degenerate sample and genuine sampleA.degenerate sample；B.superposed of degenerate sample and genuine sample

3 讨论

试验初期，笔者以蒸馏水，60%、100%甲醇和30%、50%、70%、75%、95%乙醇这8种溶剂作为提取溶剂进行比较，结果显示，以75%乙醇作为提取溶剂，所得供试品溶液出峰数相对较多。故最终选取75%乙醇作为提取溶剂。

以甲醇-水、乙腈-水作为流动相进行比较，发现乙腈-水系统洗脱的共有峰分离度不高，几个共有峰融合为一个峰，故选用分离度相对较好的甲醇-水为流动相进行试验；并选取了能使基线稳定、各峰均能有所体现的370 nm作为检测波长。

本试验所构建的红丝线药材HPLC指纹图谱有10个共有色谱峰，相似度均≥0.965，说明该指纹图谱可以代表红丝线药材的鉴别特征；通过与变质样品的HPLC图谱比较，可以很直观地看出变质样品的各色谱峰与对照图谱相似度差别很大，而这也可以作为变质药材品质评价的指标。综上所述，本试验所建立的HPLC指纹图谱专属性强、结果稳定，可作为红丝线药材质量评价的主要依据之一。

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Study on HPLC Fingerprint of Lycianthes biflora

CAO Qingxi，DENG Jiemei，JI Shengguo，WANG Dong（School of Traditional Chinese Medicine，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China）

OBJECTIVE：To establish the HPLC fingerprints of Lycianthes biflora.METHODS：HPLC was performed on the column of Dima ODS-C18with mobile phase of methanol-water（gradient elution）at a flow rate of 1.0 ml/min，the detection wavelength was 370 nm，column temperature was 30Ⅱ，and injection volume was 20 μl.Using chromatographic peak 2，the HPLC chromatograms of 11 batches were determined，and common peak identification and similarity evaluation were conducted by using Fingerprint Similarity Evaluation System of Traditional Chinese Medicine（version A in 2004）.RESULTS：There were 10 common peaks in the HPLC chromatograms of 11 batches，the similarity was no lower than 0.965.According to the verification，the HPLC chromatograms of 11 batches and reference patterns had a good consistency.CONCLUSIONS：The established fingerprint is specific，stable，and can be used for one of the main basis of quality evaluation of L.biflora.

Lycianthes biflora；Fingerprint；HPLC；Quality evaluation

R284.1

A

1001-0408（2016）36-5130-03

2015-12-31

2016-02-28）

（编辑：张 静）

广东省科技计划项目（No.2009B030801044）

＊硕士研究生。研究方向：中药质量控制。E-mail：caoqingxi_ 0223@163.com

#通信作者：副教授，硕士。研究方向：中药质量分析。电话：020-39352181。E-mail：jsgwdxy@126.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2016.36.28