树突状细胞疫苗与Ewing肉瘤

杨云松　方慧敏



树突状细胞疫苗与Ewing肉瘤

杨云松方慧敏

430030，华中科技大学同济医学院

摘要树突状细胞是目前已知的抗原提呈能力最强的细胞，可激活T细胞来攻击肿瘤细胞。树突状细胞疫苗能在体内诱导特异性免疫应答，可用于肿瘤治疗。目前树突状细胞疫苗在临床已逐渐开始使用，然而在治疗Ewing肉瘤中的应用却鲜有报道。该文就树突状细胞疫苗及其在治疗Ewing肉瘤中的应用作一综述。

关键词树突状细胞；肿瘤疫苗；Ewing肉瘤

树突状细胞(DC)是体内重要的抗原提呈细胞，可通过激活T细胞和自然杀伤细胞(NK细胞)以及直接杀伤作用来攻击肿瘤细胞。DC疫苗正是基于DC强大的抗肿瘤作用而设计的一种肿瘤疫苗，它能产生针对肿瘤抗原的特异性T细胞来杀伤肿瘤细胞。Ewing肉瘤是在青少年中发病率仅次于骨肉瘤的原发性骨恶性肿瘤，其最常见的远处转移部位是肺，且预后极差。有研究[1-2]报道，18岁以上无转移的Ewing肉瘤患者4年总生存率为60%，而发生转移的患者4年总生存率仅为20%。由于现有治疗方法对发生转移的Ewing肉瘤疗效较差，因此迫切需要探索新的治疗方法。本文就DC疫苗及其在治疗Ewing肉瘤中的应用作一综述。

1DC疫苗种类

肿瘤抗原肽负载的DC疫苗是体外使用肿瘤特异性抗原(TSA)或肿瘤相关抗原(TAA)刺激DC，使之表达肿瘤抗原肽-主要组织相容性复合体(MHC)Ⅰ复合物，再回输到体内，诱导机体抗肿瘤免疫反应。由于肿瘤抗原的异质性，可采用多抗原肽负载的方法来避免肿瘤逃逸。实验研究[3]证实，多抗原肽负载的DC疫苗细胞毒性效应显著高于单抗原肽负载的DC疫苗。

肿瘤细胞融合的DC疫苗是将全肿瘤细胞或肿瘤细胞裂解物与DC融合，其优点是无需确定TAA或TSA，而缺点是肿瘤细胞也表达自身抗原，故可能会诱导自身免疫性疾病发生，但目前尚无相关报道。有研究报道，异体来源的DC较自体来源的DC有更强的抗肿瘤效应。Koido等[4]的实验发现，来自健康者的DC与胰腺癌细胞融合的DC疫苗能在体外更好地诱导较高水平的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和干扰素(IFN)-γ产生。Kondoh等[5]研究发现，同种异基因DC与鼠恶性黑色素瘤细胞融合的DC疫苗较同基因和异种异基因DC疫苗有更强的抗肿瘤效应，且同种异基因DC疫苗在小鼠体内存活时间较长，因此推断这是其杀伤效应更为显著的原因。

基因转染的DC疫苗则是借助分子生物学手段，将TAA或TSA基因转染至DC，使DC自身能持续表达肿瘤抗原。转染DC的基因可以是DNA、mRNA及肿瘤总RNA。RNA转染方式主要有脂质体转染法、裸RNA转染法及电穿孔法，无需以病毒为载体即可获得较好的效应。而DNA转染则需以病毒为载体，且外源性DNA有可能插入基因组而诱发突变或癌变。电穿孔法转染mRNA优于脂质体转染法和裸RNA转染法，有更好的转染率和诱导特异性CTL免疫应答的能力[6]。一项临床试验[7]应用电穿孔法将编码黑色素瘤全部TAA的mRNA转染自体DC后再回输给患者，结果在患者血液及发生迟发型超敏反应的组织中检测出效应性CD4+T细胞和CD8+T细胞，且发现各类人类白细胞抗原(HLA)均可识别疫苗表面的抗原。因此，基因转染的DC疫苗优势之一是无须了解患者HLA表型，此类DC疫苗可能在临床上有更广泛的应用前景。

此外，还可将编码DC表面细胞分子的基因转染至DC来增强免疫应答效应。Bonehill等[8]应用电穿孔法将编码CD40-L、组成性活化TLR4和CD70的mRNA共转染DC，并称之为TriMix-DC。近来有学者[9]应用电穿孔法将TriMix mRNA分别与4种编码黑色素瘤TAA的 mRNA共转染至DC，制成4种TriMix-DC-MEL疫苗对患者进行皮下注射，结果显示经TriMix-DC-MEL刺激产生的抗原特异性CTL可通过血循环到达全身各处(包括皮肤组织)，这样有利于减少肿瘤转移发生。进一步研究[10]发现，淋巴结内注射TriMix-DC不仅能使DC高表达CD40、CD70、CD80、CD86 和MHCⅡ，而且可使淋巴结中促炎因子和颗粒酶B表达大幅度增加。细胞因子信号转导抑制因子(SOCS)1是酪氨酸激酶(JAK)/信号转导和转录激活因子(STAT)信号转导通路中负性调节分子的细胞内蛋白家族，抑制SOCS1可促进DC成熟及增强抗肿瘤作用[11]。将沉默SOCS1基因的siRNA与新型阳离子脂质体YSK12-C4装入多功能信封式纳米载体(MEND)来转染DC，结果转染率为90%，明显高于其他方法[12]。有学者以聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)纳米颗粒为载体，同时将沉默SOCS1基因的siRNA与卵清蛋白(OVA)导入DC内，结果显示可抑制SOCS1基因表达并促进DC分泌肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-6及IL-12，且可产生针对OVA的特异性CD8+T细胞[13]。如何增强DC疫苗的效应是未来研究重点，而增加DC表面某些细胞分子表达或抑制负性调控基因为这一研究提供了新思路。

2DC疫苗在Ewing肉瘤免疫治疗中的应用

初诊时发生转移的Ewing肉瘤往往预后较差，可能是由于Ewing肉瘤的肿瘤抗原不能有效刺激T细胞产生针对该抗原的CTL[14]。因此，将DC疫苗应用在Ewing肉瘤的治疗中可能会促进肿瘤抗原提呈，并诱导CTL产生，从而提升疗效。

2.1肿瘤抗原肽负载的DC疫苗

研究[15]表明，90%以上的Ewing肉瘤存在位于22号和11号染色体上的EWS、FLI-1基因重排，形成的融合基因EWS/FLI-1是目前诊断该疾病重要的标志物，因此EWS/FLI-1基因编码产生的抗原肽是目前研究热点。Peng等[16]将EWS/FLI-1抗原肽与DC负载并注射到表达EWS/FLI-1的Ewing肉瘤大鼠体内，结果显示该疫苗能明显减缓Ewing肉瘤生长且对自体淋巴细胞无杀伤作用，并可显著延长大鼠生存周期，实验组第60天生存率为50%，而对照组第40天全部死亡；该疫苗可促进IFN-γ分泌，增强Th1细胞免疫功能。在一项关于DC疫苗对转移及复发的Ewing肉瘤和腺泡状横纹肌肉瘤疗效前瞻性临床试验[17]中，将DC与EWS/FLI-1抗原肽负载后注射到患者体内，结果患者5年生存率从小于25%上升至43%，虽然有血小板减少、中性粒细胞减少、腹泻、腹痛、总胆红素升高及皮疹等不良反应发生，但大部分患者(77%)对治疗耐受并完成了全部疗程；大剂量化疗后淋巴细胞减少患者在输注自体淋巴细胞后对流感疫苗产生较强的免疫应答，因此认为化疗后的免疫功能不全并不会影响DC疫苗疗效。Suminoe等[18]报道1例复发的Ewing肉瘤患儿，经化疗、自体干细胞移植及DC疫苗综合治疗达到完全缓解且随访至第77个月仍生存。EWS/FLI-1抗原肽负载的DC疫苗对于转移或复发的Ewing肉瘤患者有疗效但并不够显著，可作为手术、化疗、放疗等传统治疗的辅助治疗手段，此外需进一步研究增强该疫苗疗效的方法。

2.2肿瘤细胞融合的DC疫苗

肿瘤细胞融合的DC疫苗是将Ewing肉瘤细胞通过电融合或促融剂等方法与DC融合，由于负载物是全肿瘤细胞，因此可诱导产生针对多个肿瘤抗原的CTL。DC与Ewing肉瘤细胞A673在PEG1000、10%DMSO融合剂作用下融合率达23%，并可刺激同种淋巴细胞增殖及分泌IFN-γ，产生CTL并以MHC限制性方式杀伤肿瘤细胞[19]。实验[20]显示，肿瘤细胞融合的DC疫苗对于Ewing肉瘤细胞的杀伤及抑制生长作用无论是在体内还是体外均优于肿瘤细胞裂解物负载的DC疫苗及EWS/FIL-1基因转染的DC疫苗，且该实验应用电穿孔法，融合率达16.32%。这可能是由于肿瘤的异质性使得肿瘤表面有多种抗原，而肿瘤细胞融合的DC疫苗可识别多个表位的CTL，从而达到较好的杀伤效果。近来Merchant等[21]将肿瘤细胞裂解物负载的DC疫苗用于儿童转移或复发的Ewing肉瘤及横纹肌肉瘤辅助治疗中，结果显示初诊转移的Ewing肉瘤及横纹肌肉瘤经标准治疗及DC疫苗治疗后5年生存率上升至77%，且74%患儿达到无残留病灶。由此可见，此疗法在转移或复发的Ewing肉瘤中有着较好的应用前景，且无传统化疗所带来的骨髓抑制等不良反应。

2.3基因转染的DC疫苗

王剑等[22]将Ewing肉瘤总RNA转染DC并在体外培养，结果转染的DC在体外提呈特异性肿瘤抗原能力显著增强，CD40表达水平由32. 24%增高至72.32%，CD86表达水平由31.35%增高至87.69%，而CD14表达水平则由26.37%下降至10.46%，且采用逆转录聚合酶链反应(PCR)法检测显示DC疫苗可特异性表达EWS-FLI1 mRNA，因此具有较好的靶向性。利用总RNA转染DC的优势在于无需明确患者HLA表型且总RNA包含多种编码抗原信息，故可诱导广泛的免疫应答以减少肿瘤逃避的可能性。初步临床研究[23]显示，给予患者皮下注射总RNA转染的DC后患者体内CD8+T细胞水平明显上升，且均未出现感染、发热等不良反应，而患者远期生存率需进一步随访观察。曲华毅等[24]的实验成功构建了Ewing肉瘤融合基因EWS/FIL-1重组腺病毒并转染DC；体外实验发现，EWS/FIL-1基因转染的DC疫苗对尤文肉瘤A673细胞株杀伤率为35.18%，显著高于对照组(P<0.05)。DNA转染的优势在于其转染率较总RNA转染高，尤其是采用腺病毒转染方式。然而，目前对这一靶点的研究较少，且尚无体内实验报道，因此其效应有待进一步考证。

3结语

随着肿瘤学、免疫学及分子生物学的发展，肿瘤生物治疗逐渐成为继手术、化疗及放疗后的第四大肿瘤治疗模式，其中基于免疫学的DC疫苗更是近年来研究的热点，然而其尚存在一些亟待解决的问题，如哪种培养体系能获得纯度较高的DC、哪种组织来源的DC较合适、如何将免疫佐剂与疫苗联合使用等。相信随着基因工程学、免疫学及肿瘤生物学的发展，上述问题会在不远的将来得到解决，DC疫苗也将在肿瘤生物治疗领域有更好的应用前景。

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(收稿: 2016-03-22; 修回: 2016-06-06)

(本文编辑: 卢千语)

DOI：10.3969/j.issn.1673-7083.2016.04.010