促进牵张成骨因素研究进展

娄腾飞　韩培



促进牵张成骨因素研究进展

娄腾飞韩培

200233，上海交通大学附属第六人民医院骨科

摘要牵张成骨技术目前广泛应用于治疗感染、外伤、恶性肿瘤等引起的骨骼畸形、骨缺损。此技术主要不足之处在于新生骨再生和钙化缓慢所致的牵张支架滞留时间漫长以及由此引发的各种并发症。促进牵张成骨过程中新骨形成和钙化的因素包括机械力学因素、物理因素、生物因素等。改变机械力学环境如牵张速率、牵张频率或施加压力等方法具有无创、可操作性强、价格合宜等优点。低强度脉冲超声、弱激光、脉冲电磁场等物理因素在牵张成骨中具有促成骨作用，但临床应用时应选择的最佳参数仍存在争议。生物因子、骨髓间充质干细胞、转基因技术和骨组织工程技术的研究仍处于初级阶段，其生物安全性、释放可控性、效果稳定性等都需进一步研究。该文就促进牵张成骨因素研究进展作一综述。

关键词牵张成骨；新骨形成；钙化；影响因素

骨缺损和骨不连是由创伤、感染、肿瘤、畸形等造成的常见疾病，临床上处理较困难。传统治疗方法包括自体骨移植、异体骨移植和人工骨移植等，但这些方法具有手术操作困难、植骨成活率低、存在继发性供区损伤、引发免疫排斥反应等缺点。牵张成骨技术为治疗此类疾病提供了新思路，解决了植骨材料来源不足和供区损伤等难题。牵张成骨技术利用张力-应力法则，给活体组织施加持续、稳定、缓慢的牵伸力以刺激或激活组织细胞的再生和生长, 通过控制牵拉张力促进骨与软组织再生[1]。近50年的临床实践证明，该技术已成功应用于各年龄段患者，对于骨缺损、骨不连、肢体不等长、骨畸形、骨感染等传统方法难以治愈的复杂疾病具有确切疗效，骨段延长长度无理论上的限制，新生骨横截面、质量、微观结构最终与宿主骨完全相同[2]，且在此过程中所延长骨段周围的神经、血管、肌肉、皮肤等软组织可得到同步延长。

牵张成骨技术具有上述诸多优点，在临床上应用越来越广泛，但也存在无法回避的局限性：新骨形成及钙化缓慢，治疗周期长，整个治疗过程中都需将肢体进行外支架固定，给患者的生活和工作带来了极大不便，也增加了患者的经济和精神负担；在这个过程中较易出现诸多并发症(如骨不连、新生骨骨折、新生骨偏斜畸形、针道感染、关节僵硬或强直、肌肉萎缩等)，使后期临床处理更加复杂和困难。因此，为了提高牵张成骨过程中新骨形成和钙化的速度和质量、缩短固定时间，许多学者对牵张成骨过程中促进新骨形成和钙化的因素进行了大量研究，主要集中在机械力学因素、物理因素、生物因素3方面。

1机械力学因素

促进牵张成骨过程中新骨形成和钙化的方法多种多样，其中改变机械力学环境具有无创、可操作性强、成本低等优势。

1.1牵张速率

牵张速率过低易导致截骨断端过早愈合，达不到刺激新骨形成的目的，而牵张速率过高会导致纤维骨不连、血管生成数量减少以及肌肉损伤加重[3]。目前公认的最佳牵张速率是1 mm/d。改变牵张速率可显著影响牵张成骨过程中各生物因子的表达。Cheung等[4]建立兔下颌骨牵张成骨模型，并按牵张速率将其分为常规速度牵张组(0.9 mm/d)和快速牵张组(2.7 mm/d)，结果发现在牵张成骨过程中，常规速度牵张组牵张区整个新生骨段骨形态发生蛋白(BMP)-2、BMP-4表达水平均显著升高，而快速牵张组BMP表达水平仅稍有升高且范围只局限于新生骨边缘。也有研究[5]表明，成纤维细胞生长因子(FGF)、血管内皮生长因子(VEGF)和血小板衍化生长因子(PDGF)的表达水平在快速牵张条件下均有下降。由此可见，相比于快速牵张，常规速度牵张可创造更有利于新骨形成和钙化的生物环境。如何在提高牵张速率的同时促进骨骼和周围软组织的再生，一直以来都是牵张成骨的研究热点。

1.2牵张频率

不同牵张频率可导致不同成骨效果。Peacock等[6]建立动物牵张成骨模型对比牵张频率对成骨效果的影响，将其分为2组，实验组使用自动高频牵张器，对照组使用普通牵张器，结果发现与间断牵张相比，连续牵张可显著增加牵张区新生骨量，且新生骨中央成骨细胞活性更高、新生血管更多。Kessler等[7]研究认为，不同牵张频率可导致不同成骨方式：间断牵张需更大的牵张力，每次启动牵张器都会造成血管损伤和血肿形成而阻断愈合进程，从而导致软骨内成骨；连续高频牵张则直接促使骨膜内成骨。目前认为，在有效牵张速度范围内，牵张频率与新骨形成能力呈正比。牵张频率很可能与成骨细胞活性和新生血管生成密切相关，且可导致不同的成骨方式和成骨效果。Zheng等[8]在分子生物学层面比较高频率牵张(8次/秒)和常规频率牵张(4次/日)对牵张成骨的影响，结果发现与常规频率牵张组相比，高频率牵张组新生骨中VEGF表达水平从牵张期到固定期都显著增加；FGF、BMP-2、转化生长因子(TGF)-β1 mRNA表达水平在牵张早期显著高于常规频率牵张组，而固定期这些生物因子在2组中的表达无明显差异。尽管以上实验均证实了高频率牵张在牵张成骨过程中的积极作用，但Bright等[9]在其临床实验中却得出不同结论，认为高频率(1 400次/日，每次1/1 440 mm)牵张并不能缩短骨愈合时间和降低并发症发生率。以上实验结果之所以会出现矛盾，很可能是由于不同研究所采用的评价方法不同。Bright等[9]以骨愈合时间和并发症发生率为标准判断高频率牵张是否有积极作用，而其他学者以组织学结果和(或)新生骨机械强度为判断标准。目前尚无关于高频率牵张是否对肌肉、神经、血管等软组织有积极作用的报道。此外，大多数此类研究在其实验中均未考虑高频率牵张对患者疼痛程度和镇痛药使用频率的影响。

1.3压力

目前临床上公认的经典牵张模式是 1 mm/d的牵张速率、4次/日的牵张频率。但近来越来越多的研究表明，在原有牵张模式基础上施加压力有利于新骨形成。Makhdom等[10]交替使用压力和牵张力治疗4例常规牵张成骨过程中无法形成新骨或新骨形成不良患者，在牵张开始25 d后每日早、中、晚分别施加牵张力(牵拉长度0.25 mm)、压力(压缩长度0.25 mm)、牵张力(牵拉长度0.25 mm)，平均持续6.75周，结果发现其中3例患者治疗平均5.3周后牵张间隙内有新骨形成且钙化良好，而另1例患者因严重感染而导致治疗失败，因此认为在牵张成骨过程中施加压力可有效刺激新骨形成和钙化。目前此现象的相关分子生物学机制研究报道较少。Kim等[11]为研究牵张成骨过程中施加压力对BMP-4和TGF-β1表达的影响，将建立的兔下颌骨牵张模型分为对照组(以牵张速率1 mm/d牵张8 d)和实验组(以牵张速率1 mm/d牵张10 d后，再以1 mm/d速率施加压力2 d)，结果在施加牵张力过程中，两组新生骨中BMP-4和TGF-β1表达水平均有所上调，而当对实验组施加压力时，实验组BMP-4和TGF-β1表达水平进一步得到提高并持续2周，认为在牵张成骨过程中施加压力可创出有利于新骨形成和钙化的生物学环境。然而，所施加压力大小和最佳施压时机需进一步探索。此外，压力促成骨作用的分子生物学机制也有待深入研究。

2物理因素

低强度脉冲超声(LIPUS)、弱激光(LIL)、脉冲电磁场(PEMF)等物理因素对骨形成有良好的促进作用，对于牵张成骨中新骨生成和钙化同样有着重要影响。

2.1LIPUS

LIPUS具有促进新骨形成的能力，目前已被成功应用于加速新鲜骨折以及促进骨不连愈合[12]。Salem等[13]将21例因创伤性胫骨缺损而接受牵张成骨治疗的患者随机分为2组，实验组接受20 min/d LIPUS治疗，对照组不接受LIPUS治疗，通过临床观察以及影像学检查进行评估，结果发现实验组外固定支架固定时间较对照组短95 d，且骨密度较对照组增加33%，证实LIPUS可显著促进牵张成骨治疗中新骨生成，缩短治疗时间。而LIPUS应用于牵张成骨的有效治疗时机仍存在争议。目前多数研究支持LIPUS在牵张成骨早期发挥作用[14]，其原因可能是随着牵张时间的延长，牵张间隙内新生骨量增多、骨密度逐渐升高，大部分超声能量在新生骨表面被反射和吸收，导致无法作用于骨内部。超声在正常骨皮质中传播1 mm将使其丧失>80%的能量[15]，而在牵张2周时，牵张间隙内的新生骨已有良好的连续性和较高的骨密度。为了能准确计算最终传播进入牵张间隙的超声能量值，新生骨及周围软组织的声阻抗和吸收系数等参数仍需进一步研究，且超声发射头与皮肤之间的能量损失也应予以考虑。从临床实用性角度来说，LIPUS治疗具有无创、操作方便、无不良反应、费用合理等优势，值得进一步研究与应用。

2.2LIL

LIL是指照射生物组织后不会直接造成生物组织不可逆损伤的低强度激光。LIL可增强成骨细胞活性、促进成骨细胞增殖和矿化、刺激新生血管生长，进而促进骨骼愈合与修复[16]。Medeiros等[17]建立兔股骨牵张成骨模型，并将其随机分为4组，A组为空白对照组，B组采用LIL治疗，C组采用LIPUS治疗，D组同时采用LIL和LIPUS治疗，结果显示LIL可促进牵张区新骨形成，且LIL与LIPUS联合使用效果更为显著。LIL临床疗效取决于其波长、强度、作用时机、脉冲持续时间等。然而，LIL的最佳应用强度仍存在争议。一些研究[18]建议使用高强度LIL(10～112.5 J/cm2)，而另一些研究[19]表明低强度LIL(0.03～3 J/cm2)才有效，目前多数研究支持后者。LIL剂量依从效应多用Arndt-Schulz法则阐释，即低强度激光产生生物刺激效应，而高强度激光则产生反作用[20]。LIL不仅在牵张期发挥促成骨效应，在固定期也可通过改善血液循环发挥促成骨作用[16]。现有理论认为，特定波长的LIL可促进核因子(NF)-κB迁移进入细胞核并刺激相关基因表达，进而对软组织和硬组织产生修复作用，但此过程中更确切的细胞和分子生物学机制仍需进一步研究。目前关于LIL对人体的生物刺激效应的研究尚缺乏大样本随机临床试验。

2.3PEMF

PEMF 具有无创性、操作简便、适用范围广和并发症少等优点，在临床上已应用于先天性假关节、骨折不愈合和延迟愈合、新鲜骨折、关节及脊柱融合术后的治疗。Luna-Gonzalez等[21]对使用牵张成骨技术延长双侧肢体的患者进行研究,将双侧肢体分为实验组与对照组，实验组肢体予以PEMF(75 Hz、3.5 mV，8 h/d)治疗，对照组不予以PEMF治疗，定期对患者进行X线摄片、双能X线骨密度测定以评价其成骨效果，结果显示实验组新生骨痂密度明显比对照组高，且实验组比对照组平均提前1个月拆除牵张外固定支架，证实PEMF可促进新骨形成，缩短治疗时间。但采用PEMF促进骨形成及钙化的各项参数最佳数值有待进一步确定，因为不同频率、强度、波形、振幅及作用时间均可影响PEMF的治疗效果。此外，PEMF对于人体的长期影响也有待进一步研究。

3生物因素

3.1生物因子

BMP是成骨相关因子中研究最为广泛的一种，其成骨作用已得到公认[22]。张慧等[23]研究重组人类骨形态发生蛋白(rhBMP)-7对大鼠颅骨矢状缝牵张成骨的影响，结果发现外源性BMP-7可诱导骨缝成骨细胞增殖与分化，从而促进骨缝牵张时新骨形成。有研究[24]表明， FGF、PDGF、胰岛素样生长因子(IGF)-1等外源性因子及富血小板血浆(PRP)均有在牵张成骨中促进新骨形成的作用。虽然近年来关于将生长因子应用于牵张成骨的研究已取得很大成就，但仍有许多难题需进一步解决：①生物因子的应用需要良好的控释系统，目前研究较多的方法有手术区局部注射、全身应用等，无论采用哪种方法，都必须保证在最佳时间内使生物因子在新生骨痂局部达到有效浓度[25]；②生物因子的最佳应用时机仍存在争议，许多学者在其实验中阐明了各种生物因子在牵张成骨各个时期的表达，大部分研究认为在固定期早期阶段应用生物因子效果最佳[26]；③这些生物因子的释放动力学、清除速率以及有效浓度需进一步研究；④大多数研究均证实生物因子有利于成骨，但鲜有研究直接比较各生物因子的治疗效果，因此很难选择最佳生物因子应用于临床；⑤尽管许多生物因子可人工合成并大量生产，但价格昂贵，只有研发出能够降低生产成本的新技术才能进一步提高其临床实用性。

3.2骨髓间充质干细胞

骨髓间充质干细胞(BMSC)是一种具有自我更新能力和多向分化潜能的细胞。大量研究表明局部应用BMSC可促进骨愈合，其在牵张成骨中的应用也越来越受到关注。陈燕等[27]将兔下颌骨牵张成骨模型分为实验组和对照组，实验组注射BMSC于兔下颌骨牵张成骨处，对照组予以等量生理盐水，采用X线图像分析系统计算新生骨平均灰度值，免疫组化法检测新生骨痂骨保护素(OPG)表达，结果显示实验组牵张区新生骨量、新生骨OPG表达均显著高于对照组，证明BMSC促进牵张成骨作用可能通过表达OPG来实现。但临床应用时，需先以针吸法从患者髂骨提取骨髓细胞，这对患者而言是一有创、痛苦的过程。此外，具有成骨潜能的BMSC仅占骨髓有核细胞总量的0.001%～0.01%，需进一步分离、纯化和体外培养才能得到有效浓度的BMSC，而在体外培养扩增过程中BMSC传代和老化会造成其增殖、分化能力降低[28]；单细胞悬液注入牵张间隙后，易发生BMSC吸收、扩散，难以滞留于治疗部位，且需反复大量注射，成骨效能较低。这些不足之处有望被转基因技术、骨组织工程技术弥补。

3.3转基因技术

转基因技术是将特殊的基因序列转入靶细胞中，以改变其现存的生理状态或疾病过程的一种治疗方法。干细胞通过转基因技术可在手术区持续表达一些成骨性生长因子以诱导骨快速再生。Long等[29]通过动物实验研究证实，经BMP-2 基因修饰的BMSC可在下颌骨牵张成骨过程中促进新骨形成，同时可有效代偿快速牵张对新骨形成的不利作用，认为转基因技术可在牵张局部靶向释放目的蛋白，既能维持牵张成骨区局部生长因子的有效治疗浓度，又能减少全身不良反应，规避直接使用成骨性生长因子所带来的问题。但该技术在临床应用方面仍存在不少问题：病毒载体是基因工程技术中最常用到的载体，其安全性、转导效率、免疫原性、目的基因表达的稳定性等方面均需更深入的研究和改善；BMSC在基因修饰后仍需依靠合适的载体在牵张间隙内发挥作用，载体的选择和构建往往涉及到骨组织工程技术。

3.4骨组织工程技术

骨组织工程是将前体细胞种植于具有生物相容性的三维组织样结构的支架中并结合适当生长因子以促进新骨生成的技术，其优点是提高了治疗性细胞在局部的滞留率和浓度。周诺等[30]建立兔下颌骨牵张成骨模型并将其分为4组，A组于牵张间隙注射200 μL经BMP-2基因修饰的BMSC与骨组织工程支架材料Pluronic F-127复合物，B组注射等量经BMP-2基因修饰的BMSC，C组注射等量未经BMP-2基因修饰的BMSC，D组注射等量生理盐水，术后通过X线摄片、组织切片及免疫组化法观察新生骨形成和钙化情况，发现A、B组牵张间隙内新生骨骨质量好于C、D组，其中A组好于B组，因此认为局部注射经BMP-2基因修饰的BMSC联合骨组织工程支架材料Pluronic F-127能有效促进兔下颌骨牵张成骨过程中新骨形成。胶原凝胶也是骨组织工程中常用的支架材料之一，其与脂肪源性间充质干细胞(ADSC)形成的复合物也较单独使用ADSC更有利于牵张成骨过程中新骨形成[31]。在选择合适载体时，应考虑载体材料的免疫原性、细胞毒性、降解产物全身毒性、生物活性等，因为这些因素均可影响移植细胞发挥作用，而目前仍缺乏理想的载体材料。

4结语

牵张成骨技术是目前临床上常用于治疗骨缺损、骨畸形的有效手段，应用广泛。但是牵张后新骨形成和钙化缓慢影响了该技术的临床应用效果。机械力学因素、物理因素、生物因素等都对牵张成骨过程有一定影响，但在量效关系、临床可行性、生物安全性以及应用效果等方面均有其不确定性。目前尚无可兼顾临床应用可行性与确切有效性的方法。新材料、新方法以及组织工程技术的发展有望解决牵张成骨过程中新骨形成和钙化缓慢的难题，使该技术在临床上得到更广泛的应用。

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(收稿：2015-09-23；修回：2016-06-14)

(本文编辑：李昱霏)

通信作者：韩培E-mail: Hanpei_cn@163.com

DOI：10.3969/j.issn.1673-7083.2016.04.009