黄曲霉毒素B1抗体技术研究概况

张宁

（天津市兽药饲料监察所，中国　天津　300402）

专论综述

黄曲霉毒素B1抗体技术研究概况

张宁

（天津市兽药饲料监察所，中国天津300402）

黄曲霉毒素B1是由曲霉属黄曲霉和寄生曲霉产生的具有极强毒性的致癌物，存在于粮食、干果、花生等多种农产品及其制品和饲料中。免疫分析法在黄曲霉毒素B1检测中应用十分广泛。文中主要介绍了黄曲霉毒素B1免疫分析法的核心——黄曲霉毒素B1抗体的研究概况，以期为黄曲霉毒素B1抗体及相关分析技术的研究提供参考。

黄曲霉毒素B1；半抗原；多克隆抗体；单克隆抗体；单链抗体

黄曲霉毒素是20世纪60年代初发现的一种真菌有毒代谢产物，由曲霉属黄曲霉和寄生曲霉产生。目前，在粮食、油料作物的种子、干果、调味品、发酵产品等多种农产品及其制品、饲料，甚至在一些酒类中均发现了黄曲霉毒素的存在［1］。1993年黄曲霉毒素被世界卫生组织（WHO）的癌症研究机构划定为一类致癌物［2］［3］。黄曲霉毒素最为常用的检测方法包括：薄层色谱法、高效液相色谱法、质谱法、免疫分析法等。免疫分析法主要为酶联免疫吸附试验（ELISA）和胶体金试纸条等。抗体是免疫分析方法的核心，高特异性和高敏感性的抗体是免疫分析方法构建的决定因素。在此着重对黄曲霉毒素B1抗体研究进展做一概述。

1　黄曲霉毒素和黄曲霉毒素B1

1.1分离鉴定

目前已分离鉴定的黄曲霉毒素包括AFB1、AFB2，AFB2a，AFG1、AFG2，AFM1、AFM2、AFQ1、AFQ2a等。黄曲霉毒素及其衍生物都具有双呋喃环和氧杂萘邻酮（香豆素）的结构［4］。各种黄曲霉毒素的分子量在312～346之间，熔点为268～269℃，在熔解时，各种黄曲霉毒素也随之分解。［5］黄曲霉毒素难溶于水、己烷、石油醚，在水中的最大溶解度只有10 μg/L，易溶于甲醇、乙醇、氯仿、丙酮、二甲基甲酰胺等溶液［6］。结晶的黄曲霉毒素非常稳定，高温（200℃）、紫外线照射均不能使之破坏。在酸性、中性溶液中非常稳定，在pH1-3的强酸性溶液中稍有分解，在pH 9-10的碱性溶液中，能迅速分解产生钠盐。5%次氯酸钠可使黄曲霉毒素完全破坏，Cl2、NH3、H2O2、SO2也能破坏黄曲霉毒素。高压灭菌较难破坏黄曲霉毒素。黄曲霉毒素水溶液对光较敏感，加入30%甘油可使其稳定性大为提高［7］。

黄曲霉毒素进入机体组织后，有致癌、致畸、致突变的作用［2］［3］。黄曲霉毒素B1最为常见，是目前所发现的致癌力最强的物质之一，其次是AFG1、AFG2，其他毒素含量相对微量。黄曲霉毒素进入动物体内可生成6种代谢产物，即AFM1、M2、P1、Q1、GM1、GM2，均具有毒性和致癌性，其中AFM1致癌力最强［7］。

由于黄曲霉毒素在自然界的广泛存在及其对人畜等生物的巨大危害性，世界各国及国际组织纷纷制定了食品中黄曲霉毒素Bl的限量标准。农产品黄曲霉毒素含量是国际食品卫生和农产品贸易中的必检指标。在我国，依据《GB 2761—2005食品中真菌毒素限量》，花生、玉米、花生油及其制品的AFB1≤20 μg/kg；大米及其他食用油的AFB1≤10 μg/kg；粮食、豆类、发酵食品的AFB1≤5 μg/kg；婴幼儿配方食品中不得检出。近几年来，欧盟加强了对黄曲霉毒素的控制，并实施了国际上最为严格的黄曲霉毒素限量标准，AFBl≤2 μg/kg，总黄曲霉毒素不得超过4 μg/kg。

1.2抗体

黄曲霉毒素B1抗体是动物机体受到抗原物质刺激后，由B淋巴细胞转化为浆细胞产生的，能与相应抗原发生特异性结合反应的免疫球蛋白（Immunoglobulin，Ig），称为抗体（Antibody，Ab）。抗体是机体对抗原物质产生免疫应答的重要产物，具有各种免疫功能，主要存在于动物的血液（血清）、淋巴液、组织液及其他外分泌液中。抗体分子由四条多肽链，即两条相同的相对分子质量较小的肽链（称为轻链，L链）和两条相同的相对分子质量较大的肽链（称为重链，H链）组成。轻链分为kappa（κ）与lambda（λ）两型，同一天然免疫球蛋白分子上轻链类型总是相同。重链根据其抗原性可分为γ、μ、α、ε和δ链五类，由此决定了免疫球蛋白的类型分别为IgG、IgM、IgA、IgE、IgD，同一种动物不同免疫球蛋白的差别由重链所决定。重链和轻链均存在可变区和稳定区，抗体特异性结合抗原的位置由重链可变区和轻链可变区构成（VH和VL），即为抗体的抗原结合位点［16］。

随着分子生物学技术的不断发展，抗体技术也步入分子水平，人工制备抗体已经从最初的多克隆抗体、单克隆抗体逐渐发展到基因工程抗体。抗体作为医学生物技术产业的一个重要支柱，备受研究者的青睐。

1.2抗原

凡是能够刺激机体产生抗体和效应性淋巴细胞并能与之结合引起特异性免疫反应的物质称为抗原（Antigen）。抗原分子具有抗原性，包括免疫原性和反应原性。免疫原性是指抗原能够刺激机体产生抗体和致敏淋巴细胞的特性。反应原性是指抗原与相应的抗体或效应性淋巴细胞发生特异性结合的特性。因而，根据抗原物质的抗原性，可以将抗原分为完全抗原和不完全抗原。既具有免疫原性又有反应原性的物质称为完全抗原（Complete antigen），又称为免疫原（Immunogen）。大多数的蛋白质、细菌和病毒等都是完全抗原。而只具有反应原性而缺乏免疫原性的物质称为半抗原（Hapten），亦称为不完全抗原（Incomplete antigen）。半抗原多为简单的小分子物质（分子质量小于1 ku），单独作用时无免疫原性，但与蛋白质或多聚赖氨酸等大分子载体物质结合后可产生免疫原性。大多数的多糖、类脂、药物分子等属于半抗原［16］。

AFB1相对分子量仅为312.04，属于小分子半抗原。要制备AFB1特异性抗体，需将AFB1联接到大分子载体（如蛋白质）上使之成为完全抗原。与大分子载体物质偶联的AFB1可作为免疫原或检测抗原。常用的载体有牛血清白蛋白（BSA），多聚赖氨酸，人血清白蛋白（HSA）等。

目前，在AFB1抗体研究中，最为常用的载体蛋白是BSA［5］和HSA［10］。偶联方法主要采用碳二亚胺法［8］，将AFB1与羧甲基羟胺半盐酸盐在吡啶中反应使之生成AFB1的羧甲基肟，然后在水溶性碳化二亚胺（EDPC）的催化下，与载体蛋白质分子中的游离氨基反应，从而偶联到蛋白质分子上，成为具有免疫原性的物质［13］。不同研究者对该方法进行了诸多改进，以提高肟的利用率和偶联效率，降低AFB1对动物的伤害作用［10］［7］。

也有报道采用与过往研究不同的偶联方法［5］。基于Mannich-type原理将AFB1直接与阳离子化的BSA相连构建完全抗原。在利用Balb/c小鼠制备多克隆抗体时，该抗原与常规方法合成的AFB1-oxime-BSA具有相似的敏感性，且能够更快的激活免疫反应。类似的方法在［15］的研究中也有提及。

1.3AFB1多克隆抗体

将抗原物质经不同途径注入动物体内，经数次免疫后采集动物血液，分离出血清，由此获得针对该抗原的抗血清，即为多克隆抗体（Polyclonal antibody，PcAb）。无论细菌还是病毒抗原，均是由多种抗原成分所组成，即使纯蛋白质分子也含有多种抗原表位，由此进入机体后可激活多种淋巴细胞克隆，机体可产生针对各种抗原成分或抗原表位的抗体，由此获得的抗血清是一种多克隆的混合抗体，具有高度的异质性，所制备的多抗通常含有针对其他无关抗原的抗体和血清中其他蛋白质成分。多克隆特性使之作为一种特异性的生物探针或治疗制剂仍存在不可避免的缺点。

多克隆抗体在早期AFB1检测研究中有着一定程度的应用，制备的抗体效价也不尽相同［14］。改进偶联方法，提高AFB1肟的利用率和偶联效率，制备的兔抗AFB1多克隆抗体效价高达1∶1 024 000［19］。制备了兔抗AFB1多克隆抗体，其中一株滴度亦达到1∶1 000 000，且具有很高的亲和力。利用该抗体建立的酶免疫法其检测线达到了15.8 pg/ ml。由于制备的抗体与黄曲霉毒素类物质具有一定程度的绝对交叉反应性，作者利用其中3株构建了亲和层析柱用于黄曲霉毒素的分离纯化。

为了在简化完全抗原制备过程的同时仍保持抗体的高敏感性和特异性，将AFB1与阳离子化的BSA直接偶联后制备了鼠抗AFB1多克隆抗体，以该抗体建立的竞争ELISA最低检测线为1 ng/ml，具有与常规方法所获抗体相当的敏感性。

由于多克隆抗体的多克隆特性，目前，商品化的以黄曲霉毒素B1多克隆抗体为基础构建的检测试剂盒相对较少。

1.4AFB1单克隆抗体

单克隆抗体（Monoclonal antibody，McAb）是指由一个B细胞分化增殖的子代细胞（浆细胞）产生的针对单一抗原表位的抗体［11］。该类抗体的重链、轻链及其V区独特型的特异性、亲和力、生物学性状及分子结构完全相同。单克隆抗体技术由Kohler和Milstein在1975年建立，通过体外淋巴细胞杂交瘤技术，制备了特异性的单克隆抗体。单克隆抗体技术的问世，极大推动了免疫学及其他生物医学科学的发展。相对于多克隆抗体，单抗具有高特异性、高纯度、均质性好、亲和力不变、重复性强、效价高、成本低且可大量生产等优点［6］。

经过30多年的发展，单克隆抗体已成为应用最为广泛的抗体技术。在AFB1检测领域，单克隆抗体业已逐渐替代多克隆抗体成为研究主流。越来越多的研究者致力于开发具有更高特异性、敏感性以及更广谱的AFB1单克隆抗体，以期能够大大提高检测灵敏度和检测效率。［7］利用AFB1-BSA为免疫原制备的几株针对AFB1单克隆抗体效价均达到1∶1 000 000以上，具有良好的特异性，基于此建立的竞争ELISA检测限低于0.1 ng/ml［14］。采用AFB1-HSA为免疫原，制备了两株单克隆抗体。间接竞争抑制ELISA实验表明，其中一株1B5与B1、B2、G1、G2具有不同水平的交叉反应性，另一株2F1则对上述四种物质具有相当水平的反应特性。在间接竞争抑制试验中，2F1与固相AFB1-BSA的结合反应，从开始抑制到完全抑制所需的AFB1浓度为0.5～5.0 ng/ml，说明该抗体与AFB1间具有很强的亲和力，1B5为0.5～128 ng/ml，表明该抗体与AFB1亲和力相对较弱。由此，作者认为1B5相对较弱的亲和力易于洗脱更适用于亲和层析柱，而2F1则适用于高灵敏度ELISA方法的构建。［11］利用AFB1-BSA作为免疫原建立的单抗腹水效价约1：5 000 000，利用该抗体建立的ELISA方法线性范围为0.5～50 ng/ml，最低检测线为0.01 ng/ml。由于单克隆抗体的广泛应用，类似的研究较为常见［18］。

获得高效价的抗体滴度是制备抗体的目标之一，对于单克隆抗体来说，融合之前获得高滴度的血清抗体是免疫良好的表现，也是制备高效价单克隆抗体的关键。［2］报道了记忆性淋巴细胞可能有助于免疫动物高效价抗体的形成。作者采用两种免疫方法得到了差异明显的两组免疫效果。正常免疫之后动物继续饲养8个月而不进行任何免疫，8个月之后进行加强免疫，2 w后用于单抗制备。此方法所获免疫动物血清效价达1∶20 000，远高于正常免疫条件下的1∶500［8］。记忆性淋巴细胞可能是产生该现象的主要因素。但该法由于时间跨度较大，并不适于实验室或生产条件下的广泛应用。

在制备高特异性单克隆抗体的同时，更为广谱的抗体亦受到研究者的青睐［9］。采用小剂量长周期免疫方案制备抗总黄曲霉毒素单克隆抗体。所获腹水具有相当高的抗体滴度（1∶2.65×107），与B1、B2、G1、G2的交叉反应性分别为100%、57.5%、104%、19%，而与其他霉菌毒素及BSA的交叉反应性均小于0.1%。有望利用该抗体构建高效、广谱的黄曲霉毒素检测试剂盒。

基于单克隆抗体构建的商品化试剂盒是目前市场的主力，包括r-Biopharm，Tecna等公司的黄曲霉毒素B1和总黄曲霉毒素ELISA检测试剂盒及亲和层析柱均具有较好的检测和分离效果。同时，基于单克隆抗体的黄曲霉毒素快速检测试纸条亦有较为普遍的应用。

2　AFB1单链抗体

2.1单链抗体（Single-chain antibody，ScFv）

单链抗体（Single-chain antibody，ScFv）是利用基因工程原理将天然抗体的重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）通过一条连接肽（Linker，约15-25个氨基酸）连接形成的单链分子，使抗体可变区（Fv片段）稳定下来，其分子大小仅为完整抗体的1/6［2］［4］。不仅具有单克隆抗体与抗原特异性结合的特征，更因具有分子量小、组织穿透性好、免疫原性低、易于基因工程操作和构建抗体融合蛋白等诸多优点，其在临床医学各领域，尤其在感染性疾病和肿瘤的诊断、治疗中日益显示出其潜在的应用价值［6］。

在黄曲霉毒素检测领域［19］，从抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体杂交瘤细胞中通过反转录PCR扩增出重链可变区和轻链可变区，构建了单链抗体库，最终得到3株可以稳定分泌抗黄曲霉毒素B1的ScFv菌株。诱导表达后可获得大量高亲和力的可溶性ScFv抗体蛋白。作者认为通过该研究，在今后可以将ScFv应用于花生、玉米等农产品的黄曲霉毒素B1检测试剂盒开发。在类似的研究中［12］［13］，通过提取免疫了AFB1-BSA的小鼠脾细胞RNA，经过RTPCR分别扩增出对应的重链和轻链可变区以及连接多肽基因，构建了单链抗体库并获得了三株可以稳定分泌抗黄曲霉毒素B1抗体的ScFv菌株。但在该研究中，作者应用基于该菌株表达的单链抗体进行的针对花生中黄曲霉毒素B1的检测实验并未获得有说服力的结果［9］［10］［17］。

由于ScFv的表达多采用大肠杆菌原核表达系统，因而在重组蛋白转录后加工或翻译后修饰时，特别是当重组蛋白富含二硫键时，则很容易形成包涵体造成重组蛋白不能正确折叠。另外，现有的表达系统ScFv表达产量低，未能达到实践的需求［12］［18］。但是可以肯定的是，随着基因工程抗体研制技术的发展和完善，人们可在更大程度上根据需要改造和制备抗体，ScFv的应用也将更为广泛。

2.2展望

随着抗体制备技术以及生物工程技术的不断发展，黄曲霉毒素B1抗体历经多克隆抗体、单克隆抗体，到基因工程抗体，抗体技术的不断发展也推动了黄曲霉毒素B1检测研究的快速进步。总的说来，更敏感、特异性更高以及广谱的检测方法将是黄曲霉毒素检测领域的发展趋势，由此，与之对应的具有更高特异性、高敏感性以及更广谱的抗体将是研究者不断深入研究的目标。

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信息博览

《网络食品安全违法行为查处办法》10月1日起施行

为规范网络食品交易行为，保证网络食品安全，《网络食品安全违法行为查处办法》将于2016年10月1日起施行。

《办法》规定：网络食品交易第三方平台提供者建立登记审查等制度、建立入网食品生产经营者档案、检查经营行为、发现入网食品生产经营者严重违法行为时停止提供平台服务等义务。

《办法》明确网络食品交易第三方平台提供者发现入网食品生产经营者因涉嫌食品安全犯罪被立案侦查或者提起公诉的，因食品安全犯罪被人民法院判处刑罚的，因食品安全违法行为被公安机关拘留或者给予其他治安管理处罚的，被食品药品监督管理部门依法作出吊销许可证、责令停产停业等处罚的应当停止向其提供网络交易平台服务。

《办法》规定：网络食品交易第三方平台提供者食品安全违法行为的查处，由平台提供者所在地县级以上地方食品药品监督管理部门管辖；对入网食品生产经营者的查处，由入网食品生产经营者所在地或者生产经营场所所在地县级以上地方食品药品监督管理部门管辖。因网络食品交易引发食品安全事故或者其他严重危害后果的，也可以由网络食品安全违法行为发生地或者违法行为结果地的县级以上地方食品药品监督管理部门管辖。消费者因网络食品安全违法问题进行投诉举报的，由网络食品交易第三方平台提供者所在地、入网食品生产经营者所在地或者生产经营场所所在地等县级以上地方食品药品监督管理部门处理。

网络食品交易第三方平台提供者和入网食品生产经营者有下列情形之一的，食品药品监督管理部门可以对其法定代表人或者主要负责人进行责任约谈：发生食品安全问题，可能引发食品安全风险蔓延的；未及时妥善处理投诉举报的食品安全问题，可能存在食品安全隐患的；未及时采取有效措施排查、消除食品安全隐患，落实食品安全责任等情形。

《办法》规定：网络食品交易第三方平台提供者未履行相关义务，导致发生严重危害后果的，由食品药品监督管理部门依照食品安全法责令平台停业，并将相关情况移交通信主管部门处理。《办法》还细化了“严重后果”情形：致人死亡或者造成严重人身伤害的；发生较大级别以上食品安全事故的；发生较为严重的食源性疾病的；侵犯消费者合法权益，造成严重不良社会影响等。《办法》还明确网络食品交易第三方平台提供者未按要求建立入网食品生产经营者审查登记、食品安全自查等制度的或者未公开以上制度的，由县级以上地方食品药品监督管理部门责令改正，给予警告；拒不改正的，处5 000元以上3万元以下罚款。

农业部再发狠招注水肉将无处遁行

农业部日前公布，将组织有关机构修订猪肉水分含量标注，并对注水肉严厉打击。现行猪肉水分标准太宽松，业内人士称，即便注了几十千克的水，按照现行标准检测，基本上还是合格的，对于打击注水肉并不给力。已经有人大代表就修订猪肉水分标准提出建议，农业部回应称，农业部一方面组织中国动物疫病预防控制中心（农业部屠宰技术中心）、中国肉类协会、中国畜牧兽医学会及有关科研院所等单位开展畜禽肉水分限量标准和检测方法研究，待进一步复核验证后，《畜禽肉水分限量标准》将提交全国畜禽屠宰加工标准委员会审议；另一方面，组织开展生猪屠宰监管“扫雷行动”，严厉打击注水或注入其他物质等各类屠宰违法行为，切实保障猪肉产品质量安全。业内人士介绍，不法商贩现在给动物注水，越来越隐蔽，除非当场抓住。市场取样猪肉，再检测，检测结果往往是合格的，修订肉类水分标准变得很重要。

S816.3

A

1004-5090（2016）08-0003-04

2016-06-15）