胃蛋白酶原的定量检测方法及其临床应用的研究进展▲

何忠发 骆安德 卢彦蕙 俞广全 蒙顺武 罗雪林 覃 聪

(1 广西来宾市人民医院检验科，来宾市 546100，E-mail：hzf9953@163.com；2 广西来宾市中医医院检验科，来宾市 546100)

综 述

胃蛋白酶原的定量检测方法及其临床应用的研究进展▲

何忠发1骆安德1卢彦蕙1俞广全1蒙顺武1罗雪林1覃 聪2

(1 广西来宾市人民医院检验科，来宾市 546100，E-mail：hzf9953@163.com；2 广西来宾市中医医院检验科，来宾市 546100)

胃蛋白酶原(PG)是胃蛋白酶前身，分为PGⅠ和PGⅡ。血清PG水平可反映胃黏膜组织的病变情况，如幽门螺杆菌感染和萎缩性胃炎。定量检测血清PGⅠ、PGⅡ水平及其比值可用于胃癌高危人群的筛查，过低的PGⅠ水平和PGⅠ/PGⅡ比值提示早期胃癌的可能；PGⅠ、PGⅡ水平也是监控胃癌术后复发的良好指标。本文从PG的分子结构、定量检测方法学及其临床应用等方面进行综述。

胃蛋白酶原；胃癌；萎缩性胃炎；定量检测；临床应用；综述

胃癌是全球第5大高发恶性肿瘤，死亡率高居第3。早期胃癌并无明显临床症状，导致大部分患者错过了最佳治疗时机。萎缩性胃炎是胃癌非常重要的癌前病变，发展至胃癌的风险是正常人的90倍。胃蛋白酶原(pepsinogen，PG)是胃蛋白酶前体，主要由胃黏膜主细胞分泌，分为PGⅠ和PGⅡ。血清PG水平可反映胃黏膜组织的病变情况，如幽门螺杆菌感染和萎缩性胃炎。从幽门螺旋杆菌感染到萎缩性胃炎，最后发展为胃癌的整个过程中，伴随PG的变化。联合检测血清PGⅠ和PGⅠ/PGⅡ比值(pepsinogen Ⅰ/Ⅱ ratio，PGR)是判别正常胃黏膜或慢性萎缩性胃炎，甚至是胃癌的一种可靠的无创性方法，具备“血清学活检”的作用。

1 PG的组成及结构

PG是门冬氨酸蛋白家族的一员，由375个氨基酸组成，分子量约为42 kDa，主要由胃黏膜组织合成分泌，可在胃酸刺激下活化为具备消化功能的胃蛋白酶。PG是7组胃蛋白酶同工酶的统称，根据生化特性和免疫原性的差异可将其分为2个亚群，即PGⅠ(1～5组)和PGⅡ(6～7组)[1]。PGⅠ和PGⅡ的来源不同，PGⅠ主要由胃底腺的主细胞和黏液颈细胞分泌；而PGⅡ几乎来源于所有的胃腺细胞，如胃贲门腺、胃底腺、胃窦幽门腺细胞，甚至还包括远端十二指肠Brunner腺细胞[2]。正常情况下，大部分已合成的PG直接进入胃腔，只有少数(约1%)会透过胃黏膜毛细血管进入血液循环，且保持稳定。而当患有萎缩性胃炎时，患者的胃黏膜固有腺体因长期炎症被破坏，导致腺体数量减少，胃体和胃底部的主细胞逐渐消失，此时主细胞分泌的PGⅠ大幅下降，而PGⅡ因其来源广泛，水平变化不大[3]。因此血清中PG Ⅰ和PG Ⅱ的水平可以作为胃黏膜萎缩的可靠指标。

2 PG定量检测方法

2.1 酶联免疫吸附试验 酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)是一种常见的酶免疫检测技术，其基本原理是通过酶标记的抗体或抗原与样本中的抗原或抗体进行免疫反应。ELISA检测有多种形式，如双抗体夹心法、间接法、竞争法和捕获法等，可根据样本特性和检测条件进行选择。ELISA方法具备快速、敏感、简便等优点，但其影响因素较多，只能定性或半定量检测，不能动态观察PG的变化[4]。

2.2 放射免疫分析 放射免疫分析(radioimmunoassay，RIA)是以放射性核素为标记的标记免疫分析技术。主要原理是利用同位素标记提纯的PG抗原与待测样本中的PG抗原竞争性结合定量的抗PG抗体，反应平衡后，通过测定结合和游离标记抗原的放射强度，经一定的计算法完成检测分析。RIA灵敏度高、特异性强，同时具有极其良好的微量分析效果，但是由于放射性核素具有半衰期，会影响检验结果的稳定性，同时核素具有放射性，会对人体或环境造成污染，自动化程度也不高，因此不能广泛应用于临床PG检测[5]。

2.3 时间分辨荧光免疫分析 时间分辨荧光免疫分析(time-resolved fluoroimmunoassay，TRFIA)是在荧光分析的基础上发展起来的，主要原理是采用具有二重功能的镧系元素标记抗原或抗体，与待测样本中的抗体或抗原进行免疫反应，通过特定激发光激发抗原抗体复合物内镧系元素发出特定波长的荧光，检测荧光强度来确定样本中抗原或抗体的水平。该方法测量灵敏度高，可达0.05 μg/L[6]，具有操作简便、示踪物稳定、定量分析量程宽、无放射性污染等优点[7-8]，非常有利于临床开展大规模的PG检测。在进行超微量分析时，解决激发光的杂散光影响是提高灵敏度与准确度的关键。

2.4 乳胶增强免疫比浊法 乳胶增强免疫比浊法是在免疫比浊法的基础上发展起来的一种更为稳定、准确的体液蛋白均相免疫比浊方法。其原理是将单克隆PG抗体结合在胶乳颗粒表面，待测样本中的PG抗原会与乳胶表面的PG抗体免疫结合，形成抗原-抗体-胶乳颗粒复合物，导致反应液发生浊度变化。其变化程度与样本中的PG含量成正比，可在700 nm波长处检测反应液的浊度变化。该方法检测方便，整个过程只需数分钟，具有稳定、可定量和快速的优点[9]。

2.5 光激化学发光免疫分析 光激化学发光免疫分析法是基于鲁米诺氧通道免疫分析技术建立、发展并应用于临床免疫诊断的一种新技术[10]。其主要原理是采用经过特殊处理的、大小约为200 nm的感光微球(含感光物如酞菁类物质)和发光微球(含铕螯合物)这两类纳米微球，在其表面通过不同方式结合上单克隆PG抗体，当加入待测样本时，样本中的PG抗原同时与两种感光微球表面的抗体进行免疫结合，形成复合物。检测时利用680 nm的激发光照射反应液，感光微球的感光物质受激发并将周围氧分子转化为高能态的单重态氧，该单重态氧可与发光微球上的二甲基噻吩衍生物反应并迅速将能量传递至发光微球上的铕螯合物，使其发出610 nm的红光，通过光子计数器测定发射光的光子数量测定其水平。光激化学发光免疫分析法检测PGⅠ和PGⅡ的分析灵敏度分别可达到0.8 ng/ml和0.6 ng/ml[11]。该方法是以纳米级高分子颗粒为基础的新一代化学发光技术，具有均相反应、免清洗、样本用量小、敏感度高、成本低等特点，因此可在基层医院推广应用。

2.6 流式荧光发光免疫微球分析技术 流式荧光发光免疫微球分析技术是美国Luminex公司推出的以多指标同步分析技术为基础的新一代可用于临床的高通量诊断技术，其核心技术为荧光编码微球和双激光流式检测技术[12]。检测原理是先以藻红蛋白标记的检测抗体溶液与样本中的分析物(PGⅠ、PGⅡ)反应，再使两种分别交联特异性捕获抗体的荧光编码微球悬液与分析物分别反应，形成两种夹心复合物，即“捕获抗体交联的编码微球—抗原(PGⅠ或PGⅡ)—藻红蛋白标记的检测抗体”复合物。在鞘流液的带动下，编码的微球复合物呈列状逐一通过红绿两束激光，红色可判定微球的荧光编码，确定检测的是PGⅠ还是PGⅡ，而绿色激光可检测藻红蛋白含量。每种编码微球上藻红蛋白的荧光值与样本中相应的分析物成正比，分析物水平可由相应的校准品标准曲线计算得出[13]。流式荧光发光法的最大特点在于编码微球多达100种，理论上一次反应可同时检测100项指标，如100种不同的肿瘤标志物，如果不存在交叉反应，可在一次反应中完成检测。因此该方法的单个指标检测成本大大降低。此外，流式荧光技术中整个反应为类均相的液相反应，反应时间短，不用清洗，可直接读数，检测效率高[14]。该法对PG Ⅰ和PG Ⅱ 的检测下限可分别低至0.62 ng/ml和0.21 ng/ml，线性范围上限分别可达180 ng/ml和100 ng/ml，与Abbott公司化学发光法比对，方法学性能良好[15]。

2.7 化学发光微粒子免疫分析法 化学发光微粒子免疫分析法结合化学发光技术与磁性微球技术对待测样本进行检测，如雅培ARCHITECT PG免疫检测法。该方法在磁性微球表面包被抗PG抗体，同时用吖啶酯作为标记发光剂，定量检测人血清和血浆中的PG。该方法检测PGⅠ水平下限<1.0 ng/ml，检测PGⅡ水平下限<0.5 ng/ml，其精密度、准确度、线性较好，抗干扰能力强。

3 PG定量检测的临床应用

世界卫生组织2012年调查统计结果显示新增胃癌近100万(951 594)，其中中国患者几乎占一半(42.6%)，而死于胃癌的患者也高达723 027例，中国患者占45%[16]。晚期胃癌患者5年存活率不足20%，而早期患者则高达90%，因此早期诊治成为提高胃癌患者存活率的重要手段[17]。目前各国的胃癌筛查方法有很多，确诊胃癌的“金标准”仍然是胃镜活检组织病理学检查。但胃镜技术成本高、患者痛苦大，很难用于大规模胃癌筛查，尤其是对于无临床症状的普通人群。目前，学术界已认可血清PG水平为胃癌筛查的一个高敏感性指标[18-19]。在国外，特别在日本、芬兰等国，PG的检测已得到广泛应用，利用PG进行大规模的人群普查，使胃癌的早期诊断率提高到90%，而我国胃癌的早期诊断率低于20%[20]，所以应用PG 进行大规模的人群普查非常有意义。

3.1 PG与胃癌 正常胃组织发展为胃癌是一个复杂的病变过程。大量临床研究表明胃癌患者的发病过程中常常经历浅表性胃炎—萎缩性胃炎—小肠上皮化生—结肠化生—轻度异生—中度异生—重度异生等环节，在以上病变过程中均伴随PG水平变化，即PGⅠ水平下降而PGⅡ相对稳定，这与患者的胃黏膜萎缩及两者分泌部位不同有关[20]。也有学者认为检测PG只适用于萎缩性胃癌，而对无萎缩的胃癌患者不适用，如胃贲门癌[21-22]。亚太会议上众多专家已经达成一致意见：PGⅠ水平和PGR降低是区分胃癌高风险人群的有效指标[23]。欧洲胃癌癌前病变管理指南也指出血清中PG水平可预测萎缩性胃炎[24]，因此PG检测是目前在胃癌筛查中非常可靠的一种方法。

3.2 PG与幽门螺杆菌感染 幽门螺杆菌感染已被普遍认为是慢性萎缩性胃炎的病因，血清幽门螺杆菌阳性者在1～24年中发生胃癌的危险性比幽门螺杆菌阴性者高3倍。国际癌症研究中心已将幽门螺杆菌列为Ⅰ类致癌因子[25]。Shirai等[26]报告幽门螺杆菌感染改变了胃分泌PG的情况，而通过药物清除幽门螺杆菌感染后，PG水平较治疗前降低。Ohkusa等[27]发现幽门螺杆菌感染以后血清PG水平尤其是PGⅡ大幅升高，PGR下降，且幽门螺杆菌感染灶越大PGR的降低幅度越大。这与我国研究学者的报告结果类似[28-30]。此外，PGR还可作为幽门螺杆菌根治成功与否的判断指标，成功根除幽门螺杆菌后可以改善炎细胞浸润，恢复胃分泌功能，PGR升高说明疗效显著。

3.3 PG与慢性胃炎 浅表性胃底黏膜胃炎患者血清PGⅠ与PGⅡ均升高，但PGⅡ升高率常为PGⅠ的3倍，可使PGR下降，但也有学者认为虽然PGⅠ和PGⅡ随着炎症强度增加而升高，但PG对浅表性胃炎的诊断价值还需进一步研究[31]。世界卫生组织调查发现发生胃萎缩时，随着病情加重PGⅠ水平大幅下降而PGⅡ维持不变[16]。亚洲地区关于PG的临床使用研究已经很多，已有明确证据表明检测PG水平能有效筛查萎缩性胃炎。其中，日本一项有关约30万人群的PG检测结果显示PG诊断萎缩性胃炎的灵敏度为77%，特异度为73%[32]。而另外一项大规模人群研究表明，联合检测PG、PGR，诊断萎缩性胃炎的灵敏度和特异度分别提高至93%和88%[33]。

3.4 PG与消化性胃溃疡 胃溃疡是胃腔中消化液能力超过胃黏膜组织防御力导致胃黏膜受损的一种疾病[34]。谢津璧等[35]报告胃溃疡患者血清PGⅠ、PGⅡ水平较正常人高，但PGR比正常人低。这可能是由于发生胃溃疡时，胃黏膜遭到破坏导致其通透性增加，使血液中的PG水平大大增加。也有学者报告糜烂性胃溃疡组与正常对照组的血清PGR差异无统计学意义，提示PG、PGR诊断胃溃疡的价值还需更多研究证实[36-37]。

3.5 PG与胃癌切除术后复发 多项研究对全胃切除术后PG水平进行随访调查，发现PG Ⅰ和PG Ⅱ 水平变化可作为胃癌复发的重要指标。其中，赵群等[38]报告胃癌患者术后PG Ⅰ、PG Ⅱ 和PGR均低于术前(P<0.05)，且患者复发后PG Ⅰ、PG Ⅱ 相对术后水平显著升高(P<0.05)；PG Ⅰ、PG Ⅱ 联合诊断胃癌复发的灵敏度和特异度分别为92.75%和92.35%。这与其他多项研究结果相似[39-40]，表明PG水平变化不仅可作为胃癌早期诊断的辅助指标，对胃癌患者术后复发的监测也有重要意义。4 小 结

PG作为一种新型肿瘤标志物，对于一些特殊人群，如有胃肠癌症家族史、慢性萎缩性胃炎、消化性胃溃疡、长期伴有胃肠不适症状等患者，以及在我国西北与东部沿海胃癌高发地区，可通过测定患者血清PGⅠ及PGR来早期筛查和辅助诊断胃癌；对于筛查阳性患者再进一步做胃镜活检组织病理学检查以确诊，从而提高我国胃癌患者的早期诊断率。此外，PG还可用于监测胃癌术后复发。PG水平变化对萎缩性胃炎诊断特异度最高，因此对胃癌高危人群的筛查还可联合检测糖类抗原72-4、糖类抗原19-9、癌胚抗原等多项肿瘤标志物，以提高筛查阳性率。

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广西来宾市科学研究与技术开发计划(来科转143716)

何忠发(1968～)，男，本科，副主任技师，研究方向：临床检验诊断学。

R 735.2

A

0253-4304(2016)03-0398-04

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.03.29

2015-11-29

2016-02-23)