国内外疫苗规模化生产技术研究进展

安芳兰，董文教，武发菊，葛玉凤，孙玉霞，杨惠清，李菁，刘学荣，万玉林，杨进才，殷宏

(1.中农威特生物科技股份有限公司，甘肃 兰州 730046;2.中国农业科学院兰州兽医研究所，甘肃 兰州 730046)

国内外疫苗规模化生产技术研究进展

安芳兰1，董文教1，武发菊1，葛玉凤1，孙玉霞1，杨惠清1，李菁1，刘学荣1，万玉林1，杨进才1，殷宏2*

(1.中农威特生物科技股份有限公司，甘肃 兰州 730046;2.中国农业科学院兰州兽医研究所，甘肃 兰州 730046)

文章通过从细胞产品、培养基种类以及疫苗生产等方面对国内外疫苗规模化生产技术进行综述，分析了我国兽用疫苗的生产现状，提出我国兽用疫苗的发展方向。

疫苗生产;细胞培养;培养基;生产工艺

动物细胞规模化培养技术是指在非自然条件下高密度、大规模培养动物细胞生产生物技术产品，并由生物反应器、培养基和培养工艺等基础性技术共同支撑形成的综合性技术。随着疫苗规模化生产技术突飞猛进的发展，以细胞规模化培养为载体进行疫苗生产已成为当今生物技术产业化开发中的核心支撑技术，也是生物制品生产过程中决定产品质量与成本的重要因素，日益成为当今生命科学研究和生物医药开发的强有力工具。随着生物医药产业的快速腾飞，国内外疫苗规模化生产生物过程及工艺策略概况各异，本文就国内外疫苗规模化生产技术进行概述。

1 国际上规模化疫苗生产技术概况

1.1 规模化细胞培养产品生产历史及现状国际上一些发达国家早已采用大规模细胞培养技术生产某些常规疫苗。20世纪60年代，英国AVRI研究所首次将BHK－21贴壁细胞为载体进行繁殖的口蹄疫病毒培养成功后，很快放大至30 L和100 L不锈钢罐的培养规模，极大推进了口蹄疫悬浮培养技术的进展和该技术的进步。1967年，Wellcome(现为Cooper动物保健)集团应用此项技术规模化生产兽用口蹄疫疫苗和狂犬病疫苗，将其放大至5 000 L的培养规模，并迅速将该技术推广至欧洲、非洲和南美洲等8个国家。20世纪90年代，国际上曾一度追求更大规模悬浮培养技术，将培养规模放大至万级，有的厂家其规模甚至达2.5万～3万L，但是规模越大会面临的风险也就越多，为了减少细胞培养过程中可能出现的风险，目前国际主流的培养规模回归为3 000～8 000 L。动物细胞的培养方式多采用批式或批式加量培养，进行计算机二级控制，实现完全自动化。

1.2 个性化培养基

1.2.1 随着生物制药行业的竞争日益激烈，能否及时迅速地占领市场，同时降低生产成本，提高生产效率，确保生物制品安全显得尤为重要，而作为生物制药主要原材料之一的细胞培养基，能否最大程度地满足生产的需要成为生物制药企业所面临的主要问题［1］。因此，只有根据自身的生产工艺使用符合自身要求的个性化培养基，才能在瞬息万变的市场中立于不败之地。不同的生物制品、不同的细胞株、不同的生产工艺，都需要与之对应的个性化细胞培养基来支持。

1.2.2 在国外，个性化培养基占培养基总额的70%～90%，世界上很多著名的生物制药公司(如Amgenn，Genetech)往往和培养基企业合作，建立一种“协议服务”的商业关系，研制最适合自身细胞特点的个性化细胞培养基应用于生产实践，培养基厂家为客户提供细胞培养基最优化的技术服务以及相关的技术支持，帮助其提高细胞产能，实现生产效率的大幅度提升。其主要生产及应用方式采用“合同定制”，使个性化细胞培养基的应用进一步正规化。目前许多厂家已经开始使用无血清培养基，甚至一些厂家在接毒时加入无谷氨酰胺、无血清及无热稳定剂的接毒培养基来降低外源蛋白含量及提高病毒毒价。可见个性化培养基已经成为国外培养基发展的主流，已普遍使用并产生极大的经济效益。

1.3 生物反应器设备研究及工艺放大趋势

1.3.1 近年来，动物细胞悬浮培养技术、无血清培养技术等已成为动物细胞大规模培养的发展趋势，也成为当前世界各大生物公司产业化生产疫苗等生物制品的首要选择和发展方向，大规模疫苗生产中因其在提高单位制品产量、细胞高密度培养及表达、简化生产工艺、降低生产成本、保证大规模生产制品质量等方面都有非常重要的作用，成为各大生物公司竞相开发的前沿课题。为了提高和保证疫苗质量，各国都鼓励和要求各生物公司建立起规模化、自动化的疫苗生产技术平台。

1.3.2 国外用于生产动物细胞的生物反应器已经趋于大型化、多参数、高度自动化控制。计算机控制系统与适应动物细胞对大型环境因子的高敏感性反应器的设计，正朝着人工智能以及细胞生化代谢分子水平的方向迅猛发展。规模化培养生产疫苗技术在国外早已成熟，印度、巴西、阿根廷等国已普遍采用3 000～8 000 L的生物反应器进行口蹄疫疫苗生产。

1.3.3 生物反应器细胞规模化培养的最佳选择是细胞悬浮培养，但是由于刚性反应器存在一次性投资巨大、建设周期长、设备保养费用高、需要不断灭菌与清洗操作等一系列问题，因此近几年来一次性生物反应器也已发展为生物医药(包括疫苗)产品生产的主要反应器形式，国外在规模化细胞培养领域已进入广泛使用一次性细胞培养反应器的阶段，反应器体积已达到吨级。据报道［2］，一次性生物反应器可以降低一次性投资成本(最大达到70%)，生产规模可以随疫情(市场需求)和培养滴度的提高(技术进步)做调节，节省了清洗灭菌的操作费用与时间，显著减少了污染来源，提高了生产效率。

2 国内规模化疫苗生产技术概况

2.1 细胞培养产品生产历史及现状

2.1.1 转瓶培养是一个独立的细胞培养单元，每个转瓶内细胞质量、病毒产量和滴度都不相同，致使疫苗批间差大，操作劳动强度大，隐性污染引起高内毒素等一系列问题。由于这些问题的日益突显，并且国家政策出现导向，比如在兽用疫苗生产方面，农业部公告第1708号中就已明确规定，自2012年2月1日起，各省级兽医行政管理部门停止对转瓶培养生产方式的兽用细胞苗生产线项目的兽药GMP验收申请，因此国内许多厂家竞相开始研发细胞大规模悬浮培养技术。2011年，国内相关企业开始采用悬浮培养生产方式生产口蹄疫病毒，目前口蹄疫生产厂家已基本采用悬浮培养方式生产口蹄疫病毒，其中金宇集团目前使用的反应器规模达到5 000 L，天康正在进一步优化无血清悬浮培养工艺并已生产口蹄疫病毒抗原［3］。中农威特公司自2006年下半年起加大对BHK21细胞悬浮培养生产口蹄疫病毒的工艺研究，目前已建设完成含有8个3 000 L规模的生产线，整个疫苗生产过程均采用自动化控制，全部实现管道化，并具有自主研发的BHK21细胞株、病毒培养工艺、个性化培养基、浓缩纯化等整套技术，年生产有效抗原20亿mL以上，其综合水平在兽药生产行业居领先水平。

2.1.2 动物细胞培养生产疫苗工艺过程中，国内大部分厂家疫苗生产模式还处在转瓶到悬浮培养的转型期。因此，细胞反应器悬浮培养和微载体培养技术革新在动物疫苗生产领域的研发和应用正成为行业技术革新、产业升级的重要内容。利用生物反应器生产疫苗等生物制品，实现细胞的高密度培养、高密度表达，同时保证大规模生产的产品质量，是生物制药技术的发展方向。我国应该在此领域加大国家投入，集中国内优势单位的力量协同攻关，研发生产规模化的细胞培养生物反应器核心装置，建立具有普遍指导意义的QBD驱动的细胞病毒生产过程优化策略，实现关键技术突破，解决影响疫苗质量的瓶颈问题，集成关键技术自行设计并建成国际一流的口蹄疫疫苗规模化、自动化生产线，引领重大动物疫病疫苗产业化技术进步升级，全方位地赶上发达国家的技术发展进程。

2.2 个性化培养基尽管动物细胞培养存在着巨大的潜力，但就目前而言细胞培养基仍然是制约细胞培养的关键性因素之一。由于我国规模化生产生物制品起步较晚，大多厂家使用20世纪50年代的目录培养基，而且血清浓度占用培养基成本的90%以上，成本极高。随着规模化生产技术的不断进步，虽然各种商业化的无血清培养基不断上市，但其不足之处在于细胞的适用谱极窄，并且缺乏广泛的通用性。因此，生物制药企业对生物制品的效率以及安全性提出了更高的要求，而细胞培养基作为重要的生物制药原材料，其高品质和个性化的重要性就显得尤为突出。利用生物反应器培养动物细胞生产生物制品是未来我国疫苗、抗体等生物制药产业发展的重要方向，培养条件进一步复杂化，细胞在此培养基中更易受某些机械因素和化学因素的影响而难以保存，并且不同细胞其自身的生长代谢需要不同，以及表达的目的产物不同，培养基对细胞生长的支持作用和对产物表达的促进作用也各不相，因此研发适应反应器培养的个性化培养基、无血清培养基等就成为未来生物制药行业发展的主要趋势。目前许多厂家都在自行研发适合自己生产的个性化培养基，如MERCK旗下的清大天一在国内开发了无血清悬浮培养BHK－21细胞制备口蹄疫病毒的工艺和兽用狂犬病病毒技术等，其他各个厂家也试图研发适合自己生产工艺的个性化培养基，但大多厂家还停留在研发及实验水平，大规模应用的较少［4］。中农威特公司采用多尺度科学理念，进行BKH21细胞的代谢流特征和细胞增殖能力的研究，通过DOE设计，进行高通量培养基组分筛选，建立QBD指导的个性化培养基研发技术平台，成功设计符合细胞和病毒增殖的个性化培养基，实现了BHK21细胞病毒产能和代谢副产物富积可控的规模化培养模式，目前已用于疫苗的生产，大幅度提高了细胞的产能，获得显著的经济效益。因此依据细胞特点及生产实际自行设计培养基是提高细胞培养、降低生产成本的有效途径，也是我国培养基行业的必经之路。

2.3 生物反应器及工艺放大趋势

2.3.1 我国细胞大规模培养技术起步较晚，自“七五”至“八五”攻关期间立题开展有关动物细胞生物反应器研究以来也取得了很大进展，但仍旧存在一些问题，比如哺乳动物类细胞培养技术要求高、生物反应器悬浮培养对专业技术要求较高(动物细胞大规模培养过程中生长代谢比较复杂，放大工艺较难，污染难以精确控制等)，在未能掌握核心技术的情况下，单凭模拟很难应用到新型药物生产工艺上，使国内许多生产口蹄疫疫苗的厂家大部分停留在1 000 L以内的细胞培养模式和半自动化控制状态［6］。

2.3.2 国内悬浮培养工业化生产虽然起步较晚，但已显示一定的优势，新工艺技术的应用使企业效益进一步提高，产品质量和竞争力等方面逐渐凸显。国内金宇、辽宁成大、中农威特在规模化悬浮培养技术本土化的成功，开始在生物制药行业引发一定的连锁效应，越来越多的疫苗生产企业开始关注和实践新工艺和新产品。国内已利用生物反应器对鸡传染性法氏囊病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、H9N2亚型禽流感病毒、乙型脑炎疫苗病毒株、重组乙肝疫苗病毒株等成功地进行规模化的培养和研究，但还没有得到普及，且存在着各种各样的不足［6］。生物反应器加工制造方面，国内生产的主要钢性结构生物反应器(包括成都英德研制的磁悬浮搅拌生物反应器、北京天和瑞公司研制的常规动物细胞反应器、杭州安普生物工程有限公司研制的激流灌注式生物反应器等)，都已经进入一定的规模化生产阶段，其中成都英德生物的细胞生物反应器和辅助装置处于行业领先地位，占据中国生物制品领域90%以上的市场，35%左右的市场份额在疫苗生产领域。但国产生物反应器无论在品质、品种和规模上，与国际上主要生产商的产品，如Sartorius、GE、Simens、NBS和Applikon等，还存在明显的差距，究其原因可能是国内的疫苗生产企业对国产核心设备缺乏信心，而且起步较晚，很难在短期内达到国际先进水平。因此从动物细胞大规模培养的发展趋势来看，反应器悬浮培养动物细胞技术、无血清培养技术更是我国产业化生产疫苗等生物制品的首要选择和发展方向。

3 小结

生物反应器细胞悬浮培养技术在国外疫苗生产领域已被广泛应用;国内细胞悬浮培养技术虽然起步晚，但经过几十年的研究与实践，目前已有了飞速发展。随着这一技术的进一步发展，使用生物反应器进行细胞悬浮培养生产兽用和人用疫苗将成为行业发展的必然趋势。随着生产工艺的不断完善和生物反应器设计的不断改进，生产培养细胞将会变得越来越容易。大规模动物细胞培养技术的不断成熟将更有力地推动疫苗规模化生产的发展，提高我国疫苗质量，更有效地发挥疫苗疫病防控的基础作用，推动我国从疫苗生产大国走向疫苗生产强国。

［1］张韧，王建超，朱希灿.顺应疫苗行业技术创新潮流变供应商为支撑技术提供者［J］.中国医药生物技术，2008，8(3):248.

［2］Xiao C，Huang Z，Li W，et al.High density and scaleup cultivation of recombinant CHO cell line and hybridomas with porous microcarrier Cytopore［J］.Cytotechnology，1999，30(1－3):143－147.

［3］Paillet C，Forno G，Kratje R，et al.Suspension－Vero cell cultures as a platform for viral vaccine production［J］.Vaccine，2009，27(46):6464－6467.

［4］周欣，程海卫，王永生，等.动物细胞悬浮培养技术研究进展［J］.中国畜牧兽医，2012，39(11):129－134.

［5］邹寿长，李干祥，杨葆生，等.大规模动物细胞培养技术研究进展［J］.生命科学研究，2001，5(2):102－108.

［6］王福清，易静薇，赵晓嬿，等.我国疫苗产业发展现状与展望［J］.中国生化药物杂志，2009，30(4):287－290.

Progress in Research of Vaccine Production Home and Abroad

An Fanglan1，Dong Wenjiao1，Wu Faju1，Ge Yufeng1，Sun Yuxia1，Yang Huiqing1，Li Jing1，Liu Xuerong1，Wan Yulin1，Yang Jincai1，Yin Hong2*
(1.China Agricultural Veterinary Biological Science and Technology Co.，Ltd，Lanzhou Gansu 730046，China;2.Lanzhou Veterinary Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Lanzhou Gansu 730046，China)

The review summed up the development of the scale manufacture technology home and abroad，analysising the vaccine production status in China，and putting forward the development direction of veterinary vaccines for our country.

Vaccine Production;Cell Culture;Medium;Production Process

S859.79+7

A

1007－1474(2016)05－0019－04

2016－07－26

农业部公益性行业(农业)科研专项经费项目(201303046－05)

安芳兰(1979—)，女，硕士，助理研究员(副主任)，从事疫苗生产及工艺研发工作。

*通讯作者:E－mail:yinhong@caas.cn