piRNA/PIWI在肝癌发生发展中的机制研究进展

周代兵　张凌云　许国雄



piRNA/PIWI在肝癌发生发展中的机制研究进展

周代兵张凌云许国雄

人类全基因组中仅约1%～2%的核苷酸能够被转录并翻译成蛋白质，余下98%以上均为非编码RNA (non-coding RNA，ncRNA)，可在基因水平上发挥其生物学功能[1]。在ncRNA中，核苷酸序列长度小于200bp的称为短链非编码RNA (short non-coding RNA，sncRNA)，占全部ncRNA的10%～20%[2, 3]，包括PIWI蛋白结合RNA (PIWI-interacting RNAs， piRNAs)、微小RNA (microRNA，miRNA)、重复相关小RNA(repeat associated small interfering RNAs，rasiRNA)以及小干扰RNA (small interference RNA，siRNA)[4]。肝脏恶性肿瘤是常见的消化系统肿瘤，发生率和死亡率居我国恶性肿瘤的前五位[5]。尽管2016年美国癌症总死亡率下降23%，但肝癌的发病率和死亡率却呈上升趋势[6]。肝癌的早期筛查与诊断对肝癌的治疗和预后的改善至关重要。piRNA可以在分子水平调控肝癌的发生发展，可以为肝癌的早期筛查和靶向治疗提供新的思路。

一、piRNA概述

(一)piRNA/PIWI的发现、结构特征以及生物学功能2006年，Aravin等[7]利用离心淘析和免疫共沉淀技术在雄性小鼠睾丸组织分离出一段小RNA。研究发现，此小RNA主要与Argonaute家族PIWI蛋白成员(Argonaute3、Piwi、Aubergine)[8]相互作用而将其命名为piRNA。PIWI蛋白作为piRNA/PIWI复合物中的核心组分，结合其他重要功能分子，在piRNA发挥生物功能过程中起着关键作用[9]。piRNA主要是作为PIWI的“信使”调控靶基因的稳定性表达、转录以及转录后水平的修饰[10]。

piRNA是一类长约30 nt的单链小RNA，5′端含有一个单磷酸其团，并具有强烈的尿嘧啶倾向性，3′端2-OH呈现甲基化[9]。piRNA主要存在于基因间隔区，具有成簇分布特点，基因区或重复序列区较少见[11, 12]。piRNA以高度特异链的方式对应于单链基因组位点，正义链或反义链专一性较好，在生物体内表达具有组织特异性。在果蝇实验中发现，生殖细胞中piRNA基因在Zucchini核酸酶的参与下，由lncRNA前体加工而来；转录成的初级piRNA穿过核膜到胞浆后，经定位在核周体NUAGE上的Aub和AGO3的核酸内切酶Slicer激活PIWI蛋白内切酶活性，剪切形成次级piRNA，并且通过“乒乓循环”机制使细胞中的piRNA大量扩增，最后PIWIL4蛋白结合piRNA进入核内发挥生物学效应[13-15]。

研究发现，piRNA主要存在于老鼠[7]、果蝇[16]、斑马鱼、人等哺乳动物体内的生殖细胞和干细胞中。其中，人类已发现的PIWI蛋白主要有PIWIL1(HIWI、piwi homology), PIWIL2 (PIWIL1L、CT80、Miwi like、鼠科Mili)，PIWIL3(HIWI3)和PIWIL4 (HIWI2、 MIWI2)四种亚型[17, 18]。piRNA通过与PIWI蛋白结合形成piRNA复合物，识别并结合转座子，裂解转座子基因转录产生的mRNA或沉默胞核内的转座子基因，从而调控着生殖细胞自我更新和干细胞的增殖分化[19]。除此之外，piRNA在表观遗传控制、肿瘤发生发展以及维系基因的稳定性等方面也起着重要作用[12]。

(二)piRNA/PIWI与肿瘤关系近年来，短链非编码RNA与实体肿瘤细胞增殖分化和浸润转移的研究取得很大进展，在乳腺癌、肝癌、肺癌、前列腺癌等癌症中均有大量短链非编码RNA的相关报道。自2006年发现piRNA后，piRNA/PIWI蛋白与癌症的关系引起了研究者们的关注[20]，piRNA作为短链非编码RNA成员之一，主要是通过PIWI蛋白形成piRNA/PIWI复合体参与到机体的生命活动中。短链非编码RNA可在转录和转录后水平上通过RNA诱导沉默复合物(RNA-induced silencing complex，RISC)调控基因表达，还可作为“免疫警察”监控外源核酸类似物，免遭外来威胁。Argonaute家族蛋白作为RISC重要成员之一，有三个重要RNA结合结构域，即PAZ (Piwi/Argonaut/Zwille)、MID(Middle)和Piwi (P-element-induced wimpy testis)结构域，piRNA/PIWI复合体与RISC PAZ结构域相互作用,结合到靶mRNA上进行剪切或抑制翻译[21]。

PIWI蛋白缺失后，RNA聚合酶II在染色体区域富集，导致RNA合成能力增强，促使表观遗传发生改变[9]，包括DNA高度甲基化、组蛋白去乙酰化、抑制转座子激活、染色质异构化等，这些表观遗传学的改变在肿瘤的发生发展中起着重要作用。例如DNA甲基化可引起癌基因的激活和抑癌基因的沉默，促使肿瘤失控性增生；组蛋白去乙酰化可导致细胞周期调控紊乱，DNA损伤修复受阻；休眠转座子的激活则导致基因失活等。

大量研究发现，piRNA/PIWI除在正常人体内的睾丸和造血干细胞大量表达外，在很多肿瘤组织和肿瘤细胞株均有异常表达[22]。例如在胰腺癌[23]、乳腺癌[24]和卵巢癌[25, 26]等肿瘤中，PIWI在肿瘤表达量越高，恶性程度越大，预后越差。敲低PIWI基因后，肿瘤细胞生长被抑制、恶性程度降低，暗示了piRNA/PIWI可能在肿瘤的发生发展中起重要的作用[27]。近年来，也有研究者将PIWI蛋白作为肿瘤恶性程度和预后判断的一个监测指标[28]。

二、piRNA/PIWI与肝癌关系

肝癌病情进展快、疗效差、早期易转移，临床诊断时多数患者已处于中晚期，失去了最佳治疗时机。目前对肝癌的治疗主要是以手术治疗为主，辅以介入、免疫、化疗等综合治疗，但总体效果仍不理想。研究发现，piRNA/PIWI可能与肝癌的增殖[27]、抗凋亡[29]以及侵袭转移[30]等发生发展密切相关。

前期研究发现，肝癌组织中存在一种多潜能分化的干细胞，使得肝癌细胞具有无限增殖及细胞周期调节失控特性。干细胞是肿瘤细胞的起始细胞,它具有自我更新分化的能力。PIWIL2作为人PIWI蛋白家族成员之一，在干细胞分化和肿瘤发生发展中起着重要作用，肝癌干细胞这种无限分化能力很有可能与PIWIL2有关[31]。PIWIL2过表达引起信号传导与转录激活因子3 (Stat3)表达量增加，通过Stat3/Bcl-xL和Stat3/CyclinD1两种途径，激活Stat3下游靶基因CyclinD1和抗凋亡基因Bcl-xL，导致细胞周期调控紊乱，G1期不断向S期转换，抑制凋亡；Law等[32]发现，相比邻近正常肝脏组织，piRNA piR-Hep1在原发性肝癌细胞中上调46.6%；Pearson相关分析发现PIWIL2与piR-Hep1呈现正相关(r=0.424，P=0.025)；PIWIL2可激活PI3K/AKT信号通路，使得下游基因AKT过度磷酸化，促进细胞增殖；敲低piR-Hep1后，细胞增殖能力下降，侵袭力减弱。Zhao等[30]也发现，相比正常肝细胞L02,在高侵袭性的肝癌细胞HCCLM3，MHCC97H和MHCC97L中HIWI mRNA及HIWI蛋白表达增高，组织水平也显示瘤内HIWI表达量明显高于临近正常肝组织，统计分析显示HIPI表达与增殖细胞核抗原、肿瘤大小以及转移方式正相关(P<0.05)；敲低HIWI后，细胞增殖和侵袭能力均明显下降。同时还发现，HIWI高表达(尤其低甲胎蛋白和病理Edmondson-Steiner分级为低级患者)是肝癌患者总生存期和无复发生存期缩短的一个独立危险因素，与患者的预后密切相关。

调控肝癌生物学行为的机制异常复杂，信号转导通路间相互作用可影响肝癌的发生进展和预后，这些信号转导通路包括血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)信号通路、转化生长因子-β(Transforming growth factor-β，TGF-β)信号通路、核化因子NF-κB信号通路等。在Baek等[33]构建的MT1/TGFα转基因小鼠模型中，转化生长因子-α(transforming growth factor -alpha，TGF-α)的过表达可使TGF-β失活，并使正常肝细胞获得具有恶性肝肿瘤无限增殖的特性，从而诱变为肝癌细胞。与此同时，PIWI蛋白可通过与分子伴侣蛋白如热休克蛋白90(HSP90)竞争性结合TGF-β信号转导通路中TGF-βI型受体，抑制下游的Smad2和Smad3磷酸化，导致细胞周期素依赖激酶抑制物p21和纤溶酶原激活物抑制剂1(plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1)的表达下调，引起细胞周期调控紊乱，抑制细胞凋亡，促进肿瘤细胞的无限增殖与分化[34]。也有学者研究认为PAI-1可能是通过Fas/Fas-L介导的凋亡途径产生抑制效应[35]。但是以上两项研究并没有阐明PIWI蛋白在促进肝癌细胞增殖分化中是否受到TGF-β信号通路的调控，因此还需进一步研究。另外，Ye等发现PIWI样蛋白PIWIL2可与NF-κB相互作用，通过NF-κB信号通路参与肿瘤细胞增殖分化[36]。最近也有研究发现，具有NF-κB1基因多态性的HCV(Hepatitis C virus)肝病患者罹患肝癌风险明显高于正常组[37]。同样PIWI蛋白是否参与NF-κB1基因突变诱导肝癌发生还需深入研究。

侵袭和转移是肝癌预后差、复发率高的最重要原因。侧重于肝癌的一、二级预防可为肝癌的早期诊断和预防打下基础，发现早期肝癌生物标志物对于提高肝癌切除率和生存期有重要意义。目前尽管还未见在肝癌患者中检测外周血piRNA的相关报道，但在胃癌研究中已发现外周血piR-651和piR-823通过qRT-PCR方法检测出来，且具有较高的灵敏度和特异性，可作为循环胃癌细胞检测与诊断的一个分子标志物[38, 39]用于筛查胃癌患者。从这些研究中看出对于研究肝癌相关的piRNA作为肝癌发生发展的标志物具有重要的借鉴意义。

三、总结与展望

piRNA/PIWI与肝癌发生发展密切相关，如：piRNA-651[39]、piR-Hep1[32]等,但它们与PIWI在肝癌发生发展中的具体调控机制尚不明了[40]。目前，piRNA通过Argonaute蛋白家族影响着癌症的发生发展已广泛地受到研究者的关注[41]。有研究者根据Argonaute蛋白家族在癌症中的作用，对piRNA/PIWI在肝癌发生发展中的机制进行了推测：(1) piRNA/PIWI激活上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)相关的转录因子如：Twist1/2和Zeb1/2[42]，使得E-钙黏着蛋白、波形蛋白等过表达，促进了肝癌的侵袭转移；(2) piRNA/PIWI通过DNA甲基化、组蛋白乙酰化等表观途径在转录水平上抑制转座子表达，导致基因不稳定性增加，双链DNA断裂后损伤修复异常，促使肝癌的发生；(3) piRNA与miRNA均属于非编码小RNA成员。miRNA与Argonaute蛋白相互作用以形成RNA诱导的沉默复合物(RISC)，并结合到mRNA的互补序列导致mRNA降解，在转录后水平发挥调控作用，故而有理由认为piRNA与miRNA具有相似的调控效应[43-45]。另外，piRNA还可沉默miRNA 3'-UTR区的反转录转座子，削弱miRNA的抑瘤效应[46]；(4) piRNA在转录后水平上通过Slicer酶切调控lncRNA的表达量，导致原癌基因激活或者是抑癌基因灭活，进而诱导肝癌的发生[46]。

PIWI依赖性piRNA基因生物合成机制及其在癌症中作用尚未完全明了。有研究者发现，机体内还存在一种非PIWI依赖性的piRNA通路参与机体生物调控[47]，但其是否参与肿瘤细胞的生物学行为还需进一步研究。piRNA/PIWI在肝癌发生发展中的具体机理尚处在初步阶段，借助新型高通量测序技术及后续实验的验证，将会发现更多与肝癌发生发展相关的piRNA，给肝癌治疗提供新的方向，并将有可能作为新型分子标志物用于肝癌的早期诊断、治疗以及预后判断。

[1]Consortium EP, Birney E, Stamatoyannopoulos JA, et al. Identification and analysis of functional elements in 1% of the human genome by the ENCODE pilot project. Nature, 2007, 447: 799-816.

[2]Zhang K,Shi ZM,Chang YN, et al. The ways of action of long non-coding RNAs in cytoplasm and nucleus. Gene, 2014, 547: 1-9.

[3]Chen J,Xue Y. Emerging roles of non-coding RNAs in epigenetic regulation. Sci China Life Sci, 2016.

[4]Sandhu GK,Milevskiy MJ,Wilson W, et al. Non-coding RNAs in mammary gland development and disease. Adv Exp Med Biol, 2016, 886: 121-153.

[5]Chen W,Zheng R,Baade PD, et al. Cancer statistics in China, 2015. CA Cancer J Clin, 2016， 66：115-132.

[6]Siegel RL, Miller KD.Jemal A Cancer statistics, 2016. CA Cancer J Clin, 2016, 66: 7-30.

[7]Aravin A,Gaidatzis D,Pfeffer S, et al. A novel class of small RNAs bind to MILI protein in mouse testes. Nature, 2006, 442: 203-207.

[8]Hock J, Meister G. The Argonaute protein family. Genome Biol, 2008, 9: 210.

[9]Yin H,Lin H. An epigenetic activation role of Piwi and a Piwi-associated piRNA in Drosophila melanogaster. Nature, 2007, 450: 304-308.

[10]Hirakata S,Siomi MC. piRNA biogenesis in the germline: from transcription of piRNA genomic sources to piRNA maturation. Biochim Biophys Acta, 2016, 1859: 82-92.

[11]Iwasaki YW, Siomi MC,Siomi H. PIWI-Interacting RNA: its biogenesis and functions. Annu Rev Biochem, 2015, 84: 405-433.

[12]Khurana JS.Theurkauf WE. piRNA function in germline development//StemBook. Cambridge (MA). Harvard Stem Cell Institute, 2008.

[13]Nagao A,Mituyama T,Huang H, et al. Biogenesis pathways of piRNAs loaded onto AGO3 in the Drosophila testis. RNA, 2010, 16: 2503-2515.

[14]Ipsaro JJ,Haase AD,Knott SR, et al. The structural biochemistry of Zucchini implicates it as a nuclease in piRNA biogenesis. Nature, 2012, 491: 279-283.

[15]Mohn F, Handler D.Brennecke J. Noncoding RNA. piRNA-guided slicing specifies transcripts for Zucchini-dependent, phased piRNA biogenesis. Science, 2015, 348: 812-817.

[16]Kawamura Y,Saito K,Kin T, et al. Drosophila endogenous small RNAs bind to Argonaute 2 in somatic cells. Nature, 2008, 453: 793-797.

[17]Sasaki T,Shiohama A,Minoshima S, et al. Identification of eight members of the Argonaute family in the human genome. Genomics, 2003, 82: 323-330.

[18]O'Donnell KA, Boeke JD. Mighty Piwis defend the germline against genome intruders. Cell, 2007, 129: 37-44.

[19]Aravin AA,Hannon GJ. Small RNA silencing pathways in germ and stem cells. Cold Spring Harb Symp Quant Biol, 2008, 73: 283-290.

[20]Ng KW,Anderson C,Marshall EA, et al. Piwi-interacting RNAs in cancer: emerging functions and clinical utility. Mol Cancer, 2016, 15: 5.

[21]Parker JS, Roe SM. Barford D structural insights into mRNA recognition from a PIWI domain-siRNA guide complex. Nature, 2005, 434: 663-666.

[22]Tan Y,Liu L,Liao M, et al. Emerging roles for PIWI proteins in cancer. Acta Biochim Biophys Sin(Shanghai), 2015, 47: 315-324.

[23]Grochola LF,Greither T,Taubert H, et al. The stem cell-associated Hiwi gene in human adenocarcinoma of the pancreas: expression and risk of tumour-related death. Br J Cancer, 2008, 99: 1083-1088.

[24]Fu A,Jacobs DI,Hoffman AE, et al. PIWI-interacting RNA 021285 is involved in breast tumorigenesis possibly by remodeling the cancer epigenome. Carcinogenesis, 2015, 36: 1094-1102.

[25]Lim SL,Ricciardelli C,Oehler MK, et al. Overexpression of piRNA pathway genes in epithelial ovarian cancer. PLoS One, 2014, 9: e99687.

[26]Chen C, Liu J, Xu G. Overexpression of PIWI proteins in human stage III epithelial ovarian cancer with lymph node metastasis. Cancer Biomark, 2013, 13: 315-321.

[27]Xie Y,Yang Y,Ji D, et al. Hiwi downregulation, mediated by shRNA, reduces the proliferation and migration of human hepatocellular carcinoma cells. Mol Med Rep, 2015, 11: 1455-1461.

[28]Cao J,Xu G,Lan J, et al. High expression of piwi-like RNA-mediated gene silencing 1 is associated with poor prognosis via regulating transforming growth factor-beta receptors and cyclin-dependent kinases in breast cancer. Mol Med Rep, 2016, 13: 2829-2835.

[29]Yan H,Wu QL,Sun CY, et al. piRNA-823 contributes to tumorigenesis by regulating de novo DNA methylation and angiogenesis in multiple myeloma. Leukemia, 2015, 29: 196-206.

[30]Zhao YM,Zhou JM,Wang LR, et al. HIWI is associated with prognosis in patients with hepatocellular carcinoma after curative resection. Cancer, 2012, 118: 2708-2717.

[31]Cox DN,Chao A,Baker J, et al. A novel class of evolutionarily conserved genes defined by piwi are essential for stem cell self-renewal. Genes Dev, 1998, 12: 3715-3727.

[32]Law PT,Qin H,Ching AK, et al. Deep sequencing of small RNA transcriptome reveals novel non-coding RNAs in hepatocellular carcinoma. J Hepatol, 2013, 58: 1165-1173.

[33]Baek JY,Morris SM,Campbell J, et al. TGF-beta inactivation and TGF-alpha overexpression cooperate in an in vivo mouse model to induce hepatocellular carcinoma that recapitulates molecular features of human liver cancer. Int J Cancer, 2010, 127: 1060-1071.

[34]Zhang K,Lu Y,Yang P, et al. HILI inhibits TGF-beta signaling by interacting with Hsp90 and promoting TbetaR degradation. PLoS One, 2012, 7: e41973.

[35]Fang H, Placencio VR, DeClerck YA. Protumorigenic activity of plasminogen activator inhibitor-1 through an antiapoptotic function. J Natl Cancer Inst, 2012, 104: 1470-1484.

[36]Ye Y,Yin DT,Chen L, et al. Identification of Piwil2-like (PL2L) proteins that promote tumorigenesis. PLoS One, 2010, 5: e13406.

[37]Fakhir FZ,Lkhider M,Badre W, et al. The -94Ins/DelATTG polymorphism in NFkappaB1 promoter modulates chronic hepatitis C and liver disease progression. Infect Genet Evol, 2016, 39: 141-146.

[38]Cui L,Lou Y,Zhang X, et al. Detection of circulating tumor cells in peripheral blood from patients with gastric cancer using piRNAs as markers. Clin Biochem, 2011, 44: 1050-1057.

[39]Cheng J,Guo JM,Xiao BX, et al. piRNA, the new non-coding RNA, is aberrantly expressed in human cancer cells. Clin Chim Acta, 2011, 412: 1621-1625.

[40]Jiang J,Zhang H,Tang Q, et al. Expression of HIWI in human hepatocellular carcinoma. Cell Biochem Biophys, 2011, 61: 53-58.

[41]Siddiqi S. Matushansky I Piwis and piwi-interacting RNAs in the epigenetics of cancer. J Cell Biochem, 2012, 113: 373-380.

[42]Wang M,Ren D,Guo W, et al. Loss of miR-100 enhances migration, invasion, epithelial-mesenchymal transition and stemness properties in prostate cancer cells through targeting Argonaute 2. Int J Oncol, 2014, 45: 362-372.

[43]Paulmurugan R. MicroRNAs - a new generation molecular targets for treating cellular diseases. Theranostics, 2013, 18: 927-929.

[44]Burroughs AM, Ando Y,de Hoon MJ, et al. Deep-sequencing of human Argonaute-associated small RNAs provides insight into miRNA sorting and reveals Argonaute association with RNA fragments of diverse origin. RNA Biol, 2011, 8: 158-177.

[45]Meister G. Argonaute proteins: functional insights and emerging roles. Nat Rev Genet, 2013, 14: 447-459.

[46]Watanabe T,Cheng EC,Zhong M, et al. Retrotransposons and pseudogenes regulate mRNAs and lncRNAs via the piRNA pathway in the germline. Genome Res, 2015, 25: 368-380.

[47]Dufourt J,Brasset E,Desset S, et al. Polycomb group-dependent, heterochromatin protein 1-independent, chromatin structures silence retrotransposons in somatic tissues outside ovaries. DNA Res, 2011, 18: 451-461.

(本文编辑：张苗)

201508上海复旦大学附属金山医院中心实验室

许国雄，Email：gboxu@163.com

2016-04-08)