环介导等温扩增技术在畜牧兽医中的应用研究

2016-03-10王韦华刘桂梅陕西省渭南职业技术学院陕西渭南714000

甘肃畜牧兽医 2016年13期

王韦华，刘桂梅（陕西省渭南职业技术学院，陕西渭南 714000）

王韦华，刘桂梅
（陕西省渭南职业技术学院，陕西渭南 714000）

随着科学技术的进步，畜牧兽医中对动物的检测技术有了很大的进步，一种名为环介导等温扩增技术的分子生物检测技术，凭借着特异性强、敏感度高、操作方便快捷等特点，正在受到越来越多生物医学研究者所关注。研究表明，将环介导等温扩增技术英语畜牧兽医的检测当中有着非常重要的实际意义。因此，本文主要就环介导等温扩增技术在畜牧兽医中的应用进行了研究，介绍了环介导等温扩增技术的技术原理，分析了环介导等温扩增技术在畜牧兽医的实际应用思路，希望通过此次研究为环介导等温扩增技术未来的深入研究和应用提供参考和借鉴。

环介导等温扩增技术；畜牧兽医；应用

环介导等温扩增技术是2000年由日本研究者Notomi等人在综合前人的发展成果的基础上开发了一种新的体外扩增特异DNA片段的分子生物学技。环介导等温扩增技术基本原理是针对六个特定区域设计四条特殊引物，利用具有链置换活性的DNA聚合酶（Bst DNA聚合酶），在60～65 ℃的温度范围内实现对核酸的有效扩增。因此，凭借着环介导等温扩增技术具有特异性强、敏感度高、操作方便快捷等特点，将环介导等温扩增技术应用于畜牧兽医当中将在无需借助昂贵的仪器设备的情况，更快更准确的对动物疫病做出检测［1］。

1　环介导等温扩增技术的简介

环介导等温扩增技术针对靶序列六个特定区域，我们需要设计四条特殊引物，利用具有链置换活性的DNA聚合酶（Bst DNA聚合酶）在60～65 ℃条件下催化新链合成，从而达到短时间内对核酸有效扩增的目的。其中四条特殊的引物分为两对内外引物。在环介导等温扩增的反应中，内引物与目标DNA交杂，开始互补链的合成，产生哑铃状的DNA，这种合成持续延伸，进而形成茎环DNA结构，成为环介导等温扩增循环的起始结构。具体是内引物夹杂在茎环DNA结构上，使得引物链置换合成的有缺口的中间媒介，茎上附这的便是目标序列，然后，通过外引物，在茎的末端合成环状结构，周而复始，便在同一DNA链上形成诸多花椰菜结构的茎环DNA机构。我们对经过环介导等温扩增后的混合物进行电泳，由于扩增产物是一系列反向重复的靶序列构成的茎环结构和多环花椰菜样结构的DNA片段混合物，其在电泳后在凝胶上会呈现出不同大小区带的阶梯式图谱，我们可以通过对图谱的不同显示情况来判断动物的疫病情况，从而达到对动物的检测。

2　环介导等温扩增技术在畜牧兽医领域的应用

首先，环介导等温扩增技术可以用于动物真菌的检测。一直以来，病毒都是导致动物生病和死亡的主要原因，因此在畜牧兽医中对动物病毒的检测是动物疫病防治的只要工作之一。在畜牧兽医中对于动物危害最为普遍的便是禽流感，由于畜牧业动物都比较集中，一旦发生禽流感往往会给牧民造成巨大的经济损失。传统的禽流感病毒的检测一般是采取病毒分离的检测方法，检测周期长过长一直是次检测方法发主要弊端，此外我们也可以常规PCR等核酸诊断技术的方法对病毒进行检测，虽然这种检测方法敏感性高，但往往需要用到昂贵且操作复杂的仪器和试剂，对于畜牧兽医中临床现场检测的实现比较困难。而在畜牧兽医中应用环介导等温扩增技术，就能极大提高动物病毒检测的速率，且操作方便快捷，无需借助昂贵的检测仪器便可实现。在对猪圆环病毒检测时，根据猪圆环病毒与基因组的构成针对PCV2引入四对特异性引物，在60 ℃的情况下对幼崽猪进行环介导等温扩增，若60 min内发生反应这证明PCV2的存在，反之则不存在。以此方法从而达到对幼崽猪PCV2的快速简单的检测，且这种检测方法灵敏度高，与猪的PCV1、猪伪狂犬病毒以及猪细小病毒的检测无干扰，确保了PCV2病毒检测的准确性［2］。

其次，环介导等温扩增技术可以用于动物细菌的检测。动物细菌的感染也是动作致病的一大原因之一，其中如产肠毒素性大肠杆菌（ETEC）不仅是导致人生病的一大细菌，也是导致动物疾病产生的一大原因。传统的细菌检测方法一般是采取将细菌分离方法以达到检测的目的，这种方法不仅操作复杂，花费的时间比较久，且检测结果容易与其他型大肠杆菌的影响［3］。

最后，环介导等温扩增技术可以用于动物真菌的检测。在畜牧兽医中我们常常会遇到真菌检测，比如奔马性赭粉菌是一种不完全真菌，这种真菌是动物性传染病与急性真菌感染的一大根源，其对猫和鸟动物的中枢神经系统和呼吸道的危害最为巨大，对用畜牧业的影响也是非常大。因此，在对动物真菌检测是，我应用环介导等温扩增技术针对奔马性赭粉菌DNA中LSU rDNA序列的特定区域设计特异性引物，应用于环介导等温扩增技术对其进行检测，这种方法准确且迅速，检测结构不易受到其他真菌的影响。