细菌磷壁酸的免疫调控作用及与其结构的关系

高权新　彭士明　张晨捷　姚　震　张　慧　施兆鸿*

(1.中国水产科学研究院东海水产研究所，农业部东海与远洋渔业资源开发利用重点实验室，上海200090；

2.德州职业技术学院，德州253034；3.天津市滨海新区

大港农业服务中心兽医站，天津300270)



细菌磷壁酸的免疫调控作用及与其结构的关系

高权新1彭士明1张晨捷1姚震2张慧3施兆鸿1*

(1.中国水产科学研究院东海水产研究所，农业部东海与远洋渔业资源开发利用重点实验室，上海200090；

2.德州职业技术学院，德州253034；3.天津市滨海新区

大港农业服务中心兽医站，天津300270)

摘要：磷壁酸是革兰氏阳性菌细胞壁的重要组分，在致病菌诱发炎症和益生菌免疫调控过程中担当重要作用，并保持了细菌的多种生理功能，现已成为当今的研究热点。本文对致病菌磷壁酸的免疫刺激作用、益生菌磷壁酸的免疫调控作用、敲除磷壁酸基因对细菌的影响、磷壁酸结构及其与功能的关系进行综述，旨在为磷壁酸的研究与应用提供新线索。

关键词：磷壁酸；免疫调节；结构

早期对细菌的研究主要将整个细菌作为研究对象，随着研究的深入，人们开始探索菌体成分的理化功能。磷壁酸是革兰氏阳性菌特有的膜成分，主要由16～40个磷酸二酯键连接而成的甘油组成。磷壁酸的结构是由疏水部分(通过磷酸二酯键与细胞膜结合的类脂)和亲水部分(磷酸甘油酯)组成，所以磷壁酸属于双性体分子物质。磷壁酸是一类病原相关分子模式(pathogen associated molecular patterns,PAMPs)，能够特异性激活动物的Toll样受体2(TLR2)信号传导通路，从而诱发一系列的免疫应答反应[1]。不同的细菌，尤其是致病菌与益生菌之间，其磷壁酸的免疫特性有很大的差别。益生菌的磷壁酸大多具有益生特性，而致病菌的磷壁酸往往具有致病性。这种功能特性上的差异是由磷壁酸不同的结构引起的[2]，所以磷壁酸的功能特点和结构具有种的特异性。

磷壁酸是革兰氏阳性菌发挥生理功能的重要表面分子，其保持了细菌原有的多种生物学活性。粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)的磷壁酸能够降低抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平、提高促凋亡蛋白Bax的表达水平和半胱氨酸蛋白酶(caspase-3)的活力，从而诱导人的成骨细胞样细胞(human osteoblast-like cells)的凋亡、坏死[1]。研究发现，磷壁酸还具有抗畜禽病毒的作用，是一种潜在的防治病毒的“药物”[3]。此外，众多专家学者从组织、器官及整体水平上证明了双歧杆菌磷壁酸具有延缓衰老的作用[4]。磷壁酸具有的免疫特性正在被一步步的发掘出来，所以深入解析磷壁酸的功能特性及其结构对于疾病的防治和丰富对细菌的认识等都具有重要的意义。

1致病菌磷壁酸的免疫刺激作用

致病菌会诱导寄主细胞表达、分泌大量的炎性因子，从而引发炎症，对组织细胞造成损伤。磷壁酸是革兰氏阳性菌的重要免疫刺激成分，能诱导产生大量炎性因子的表达。变异链球菌(Streptococcusmutans)是一类与蛀齿有关的致病菌，能够引起牙髓发炎。研究发现，变异链球菌的磷壁酸能够通过激活小鼠巨噬细胞的TLR2信号传导通路，诱发炎症反应[5]。Ahn等[6]发现，金黄色葡萄球菌(Staphylococusaureus)磷壁酸能够通过激活小鼠巨噬细胞的TLR2和细胞内模式识别受体2(NOD2)诱导环氧化酶-2(COX-2)的过量表达，从而诱发炎症反应。Huang等[7]发现金黄色葡萄球菌的磷壁酸能够诱导大鼠神经胶质细胞诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、COX-2、血红素氧合酶1(HO-1)的表达，激活丝裂原活化蛋白激酶(p38)、c-jun氨基末端激酶(JNK)、丝/苏氨酸蛋白激酶(AKT)信号通路，活化转录因子核转录因子κB(NF-κB)和转录激活因子1(AP-1)，并对寄主细胞造成损伤。鉴于磷壁酸对致病菌的生理机能及传染特性具有重要的作用，众多专家学者已经着手于研制能够抑制致病菌合成磷壁酸的药物，将磷壁酸作为药物靶点，抑制磷壁酸的合成，从而达到防治致病菌感染的效果[8]。

2益生菌磷壁酸的免疫调控作用

磷壁酸保留了益生菌原有的免疫调控作用，能够增强寄主的免疫功能。福氏志贺氏菌(Shigellaflexneri)的肽葡聚糖能够活化NF-κB，激活单核细胞，从而诱发严重的免疫反应，最终会引发肠道疾病和克罗恩病等。Kim等[9]发现植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)的磷壁酸能够缓解由福氏志贺氏菌肽葡聚糖诱发人单核(THP-1)细胞的过度免疫反应，降低肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素-1β(IL-1β)的表达量，抑制NF-κB和细胞分裂素活化蛋白激酶(MAPK)的活化，从而增加寄主细胞的免疫耐受力。Noh等[10]发现植物乳杆菌的磷壁酸能够通过抑制人肠道细胞TLR2的活力并阻止Pam2CSK4(TLR2激动剂)引起的p38、JNK和NF-κB的活化，从而抑制严重的炎症反应。植物乳杆菌磷壁酸与金黄色葡萄球菌磷壁酸相比，对THP-1细胞的免疫刺激作用较弱，并能够抑制金黄色葡萄球菌磷壁酸诱导的血小板活化因子受体(PAFR)、TLR2、Toll样受体4(TLR4)、CD14(脂多糖受体)的表达，从而发挥免疫保护作用[11]。

益生菌磷壁酸的免疫调控作用，因细菌种类的不同而存在差异。Kaji等[12]发现干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)能够诱导小鼠巨噬细胞炎性因子白细胞介素-12(IL-12)的表达，仅刺激少量炎性抑制因子白细胞介素-10(IL-10)的表达(IL-10是炎症与免疫抑制因子，能够抑制过度的炎性反应)；但是植物乳杆菌磷壁酸能够抑制干酪乳杆菌诱导的IL-12的表达，显著增加IL-10的含量，这一改变有助于维持细胞的正常状态，减少细胞损伤。Jeong等[13]分别提取了植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)、Lactobacillusdelbreukii、沙克乳杆菌(Lactobacillussakei)K101的磷壁酸，发现植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌的磷壁酸能够适度的刺激大鼠巨噬细胞264.7细胞产生炎性因子，但是Lactobacillusdelbreukii、沙克乳杆菌K101却刺激产生了大量的炎性因子，并诱发了严重的免疫反应。经分析发现，这些细菌磷壁酸的糖脂结构是由不同种类、不同长度的脂肪链组成；不同的乳杆菌磷壁酸所具有的免疫调控能力存在着差异，这是由磷壁酸的特有结构决定的。

3敲除磷壁酸基因对细菌的影响

益生菌能够治疗炎性肠疾病(inflammatory bowel diseases,IBD)，这种治疗作用备受关注。Mohamadzadeh等[14]、Grangette等[15]、Claes等[16]分别将嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌的磷壁酸基因敲除，结果发现这些敲除了磷壁酸基因的益生菌具有了更有效的免疫调节作用。嗜酸乳杆菌磷壁酸突变株(敲除磷壁酸基因)与野生菌相比，具有更强的免疫调控作用：显著降低了小鼠树状突细胞IL-12、TNF-α的表达量，增加炎性抑制因子IL-10的含量，阻止了CD4(+)T细胞的活化，从而抑制了过度的炎性反应[14]。植物乳杆菌磷壁酸突变株与野生菌相比，能够更显著地降低小鼠外周血单核细胞IL-12、TNF-α以及干扰素-γ(IFN-γ)的分泌量，增加IL-10的表达量；临床试验发现，植物乳杆菌磷壁酸突变株与野生菌相比，能够更有效地治疗小鼠的大肠炎[15]。此外，植物乳杆菌磷壁酸突变株与野生菌相比，还具有抑制大鼠内脏疼痛感知(visceral pain perception)的作用[17]。鼠李糖乳杆菌磷壁酸突变株与野生菌相比，亦能更有效地治疗小鼠的大肠炎，其过程伴随着IL-12、TLR2、IFN-γ表达量的降低[16]。益生菌磷壁酸突变株与野生菌相比，对寄主细胞的负面损伤减小[18]，并且具有更有效的益生作用。敲除磷壁酸对细菌自身的生长、形态、细胞分裂以及细胞壁的形成等都有显著的影响。研究发现，鼠李糖乳杆菌磷壁酸突变株的菌体长度增加，隔膜不易成形，耐酸碱能力下降等[19]；植物乳杆菌磷壁酸突变株的菌体长度增加，细胞不易分裂，自溶率增加，肽聚糖水解酶的表达量发生变化等[20]。敲除磷壁酸基因后的细菌，其形态结构、繁殖力、免疫调控功能等理化特性都发生了改变，这些改变必然关乎益生菌对寄主的益生作用，其详细的作用特点有待进一步研究确定。

4磷壁酸的结构及与其功能的关系

磷壁酸是革兰氏阳性菌细胞壁的特有结构和重要组分，由核糖醇或甘油残基经磷酸二酯键相互连接而成的阴离子聚合物，其链上羟基大多由丙氨酸或N-乙酰葡萄糖胺修饰，通常带有一定量的负电荷，形成正负电荷交替出现的链状聚合物结构。虽然革兰氏阳性菌磷壁酸皆具有一个相似的基本结构，但是不同种类的细菌磷壁酸存在着差异。低胞嘧呤(G)+鸟嘌呤(C)含量的革兰氏阳性菌(硬壁菌门)磷壁酸有2条脂肪酸“尾巴”的疏水链锚入细胞膜中，还有1条长的带有电荷的亲水链分布在不同的区域，其电荷的特点与菌种有关。大多细菌磷壁酸的亲水区域是1条由1,3-磷酸二酯键连接的甘油-磷酸基团多聚化合物，并有D-丙氨酸或糖基修饰。疏水链大多是1个糖基链，一般是由葡萄糖基(Glc)(β1-6)修饰的甘油二酯[21]。

金黄色葡萄球菌和链球菌是能够引起脓毒病的致病菌，经研究发现金黄色葡萄球菌的磷壁酸有30～50个多聚甘油-磷酸(poly-Gro-P)，其主要由D-丙氨酸和N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)修饰。Stadelmaier等[22]采用人工化学合成的方法合成了磷壁酸的类似化合物，即(D-丙氨酸)4(N-乙酰氨基葡萄糖)1(甘油-磷酸)6；研究发现，合成的磷壁酸类似物能够诱导炎性因子的分泌，与天然的磷壁酸具有相似的免疫刺激作用[22-23]。D-丙氨酸和甘油-磷酸对磷壁酸的免疫调节具有较大的影响，而N-乙酰氨基葡萄糖的作用却可以忽略；将D-丙氨酸转换成L-丙氨酸后，磷壁酸的免疫刺激作用显著降低[22]。

乳酸菌的磷壁酸有多聚D-丙氨酸结构，其锚入细胞膜的糖脂是由三己糖-甘油二酯组成。许多乳酸菌，诸如干酪乳杆菌YIT9029、发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)YIT0159都能诱导寄主细胞促炎性因子肿瘤坏死因子(TNF)的表达；而植物乳杆菌却只诱导少量促炎性因子的表达。此外，研究发现，从植物乳杆菌磷壁酸突变株分离提取的磷壁酸与野生菌的磷壁酸相比，其诱导的促炎性因子的表达量也较少。这可能是由于突变菌磷壁酸的D-丙氨酸和糖基的结构、数量以及甘油-磷酸链的长度的改变引起的[20]。与金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的磷壁酸相比，植物乳杆菌几乎不会刺激264.7细胞产生一氧化氮(NO)，而且活化TLR2/CD14的程度较弱，诱导产生的TNF也较少[24]。不仅如此，植物乳杆菌磷壁酸还可减少金黄色葡萄球菌诱导的TNF的表达，抑制脂多糖诱导单核细胞分泌TNF，治疗脂多糖引起的小鼠的内毒素休克症，缓解弗累克斯讷氏杆菌(Shigellaflexneri)肽聚糖诱发的炎性反应[9,25-26]。对比分析金黄色葡萄球菌和植物乳杆菌的磷壁酸发现，两者的最大不同点是在磷壁酸糖脂部分中酰基链的饱和程度(植物乳杆菌的不饱和脂肪酸)和数量(植物乳杆菌的第三酰基链)，还有甘油-磷酸链的糖基取代物；二者具有相似的D-丙氨酸[4]。由此可见，磷壁酸的脂链(酰基链的长度以及饱和程度)和甘油-磷酸链(D-丙氨酸和糖基)在磷壁酸发挥免疫刺激及调控方面具有的重要作用。

5小结

从国内外的文献中可以看出，磷壁酸作为革兰氏阳性菌细胞壁的重要组分，在细菌诱发炎症、免疫调控中的作用，以及与其结构特点的关系已逐被阐明，这使细菌作用特点及机理的研究已逐步深入到在细菌组分层面的探索，然而许多问题仍需要进一步的探讨和解答。比如，益生菌的磷壁酸具有免疫调控的功能，许多专家也指出，磷壁酸可作为免疫佐剂；但是亦有许多文献指出，益生菌的磷壁酸被基因敲除后，具有了更好的免疫调控作用，这之间存在着矛盾，需要开展相关的研究进行分析和鉴定。

参考文献：

[1]TIAN Y G,ZHANG X L,ZHANG K,et al.Effect ofEnterococcusfaecalislipoteichoic acid on apoptosis in human osteoblast-like cells[J].Journal of Endodontics,2013,39(5):632-637.

[2]JANG K S,BAIK J E,HAN S H,et al.Multi-spectrometric analyses of lipoteichoic acids isolated fromLactobacillusplantarum[J].Biochemical and Biophysical Research Communications,2011,407(4):823-830.

[3]HADDADI S,THAPA S,KAMEKA A M,et al.Toll-like receptor 2 ligand,lipoteichoic acid is inhibitory against infectious laryngotracheitis virus infectioninvitroandinvivo[J].Developmental & Comparative Immunology,2015,48(1):22-32.

[4]王春耀,张德纯.双歧杆菌脂磷壁酸抗衰老的研究现状[J].中国微生态学杂志,2011,23(3):277-279.

[5]HONG S W,BAIK J E,KANG S S,et al.Lipoteichoic acid ofStreptococcusmutansinteracts with Toll-like receptor 2 through the lipid moiety for induction of inflammatory mediators in murine macrophages[J].Molecular Immunology,2014,57(2):284-291.

[6]AHN K B,JEON J H,BAIK J E,et al.Muramyl dipeptide potentiates staphylococcal lipoteichoic acid induction of cyclooxygenase-2 expression in macrophages[J].Microbes and Infection,2014,16(2):153-160.

[7]HUANG B R,TSAI C F,LIN H Y,et al.Interaction of inflammatory and anti-inflammatory responses in microglia byStaphylococcusaureus-derived lipoteichoic acid[J].Toxicology and Applied Pharmacology,2013,269(1):43-50.

[8]SEWELL E W,BROWN E D.Taking aim at wall teichoic acid synthesis:new biology and new leads for antibiotics[J].The Journal of Antibiotics,2014,67(1):43-51.

[9]KIM H G,LEE S Y,KIM N R,et al.Lactobacillusplantarumlipoteichoic acid down-regulatedShigellaflexneripeptidoglycan-induced inflammation[J].Molecular Immunology,2011,48(4):382-391.

[10]NOH S Y,KANG S S,YUN C H,et al.Lipoteichoic acid fromLactobacillusplantaruminhibits Pam2CSK4-induced IL-8 production in human intestinal epithelial cells[J].Molecular Immunology,2015,64(1):183-189.

[11]KIM H,JUNG B J,JEONG J,et al.Lipoteichoic acid fromLactobacillusplantaruminhibits the expression of platelet-activating factor receptor induced byStaphylococcusaureuslipoteichoic acid orEscherichiacolilipopolysaccharide in human monocyte-like cells[J].Journal of Microbiology and Biotechnology,2014,24(8):1051-1058.

[12]KAJI R,KIYOSHIMA-SHIBATA J,NAGAOKA M,et al.Bacterial teichoic acids reverse predominant IL-12 production induced by certainLactobacillusstrains into predominant IL-10 production via TLR2-dependent ERK activation in macrophages[J].The Journal of Immunology,2010,184(7):3505-3513.

[13]JEONG J H,JANG S,JUNG B J,et al.Differential immune-stimulatory effects of LTAs from different lactic acid bacteria via MAPK signaling pathway in RAW 264.7 cells[J].Immunobiology,2015,220(4):460-466.

[14]MOHAMADZADEH M,PFEILER E A,BROWN J B,et al.Regulation of induced colonic inflammation byLactobacillusacidophilusdeficient in lipoteichoic acid[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2011,108(S1):4623-4630.

[15]GRANGETTE C,NUTTEN S,PALUMBO E,et al.Enhanced antiinflammatory capacity of aLactobacillusplantarummutant synthesizing modified teichoic acids[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2005,102(29):10321-10326.

[16]CLAES I J J,LEBEER S,SHEN C,et al.Impact of lipoteichoic acid modification on the performance of the probioticLactobacillusrhamnosusGG in experimental colitis[J].Clinical & Experimental Immunology,2010,162(2):306-314.

[17]DUNCKER S C,WANG L,HOLS P,et al.TheD-alanine content of lipoteichoic acid is crucial forLactobacillusplantarum-mediated protection from visceral pain perception in a rat colorectal distension model[J].Neurogastroenterology & Motility,2008,20(7):843-850.

[18]MILETI E,MATTEOLI G,LLIEV L D,et al.Comparison of the immunomodulatory properties of three probiotic strains ofLactobacilliusing complex culture systems:prediction forinvivoefficacy[J].PLoS One,2009,4(9):e7056.

[19]PEREA VÉLEZ M,VERHOEVEN T L A,DRAINQ C,et al.Functional analysis ofD-alanylation of lipoteichoic acid in the probiotic strainLactobacillusrhamnosusGG[J].Applied and Environmental Microbiology,2007,73(11):3595-3604.

[20]PALUMBO E,DEGHORAIN M,COCCONCELLI P S,et al.D-alanyl ester depletion of teichoic acids inLactobacillusplantarumresults in a major modification of lipoteichoic acid composition and cell wall perforations at the septum mediated by the Acm2 autolysin[J].Journal of Bacteriology,2006,188(10):3709-3715.

[21]NEUHAUS F C,BADDILEY J.A continuum of anionic charge:structures and functions ofD-alanyl-teichoic acids in gram-positive bacteria[J].Microbiology and Molecular Biology Reviews,2003,67(4):686-723.

[22]STADELMAIER A,MORATH S,HARTUNG T,et al.Synthesis of the first fully active lipoteichoic acid[J].Angewandte Chemie International Edition,2003,42(8):916-920.

[23]DEININGER S,STADELMAIER A,VON AULOCK S,et al.Definition of structural prerequisites for lipoteichoic acid-inducible cytokine induction by synthetic derivatives[J].The Journal of Immunology,2003,170(8):4134-4138.

[24]RYU Y H,BAIK J E,YANG J S,et al.Differential immunostimulatory effects of Gram-positive bacteria due to their lipoteichoic acids[J].International Immunopharmacology, 2009,9(1):127-133.

[25]KIM H G,LEE S Y,KIM N R,et al.Inhibitory effects ofLactobacillusplantarumlipoteichoic acid (LTA) onStaphylococcusaureusLTA-induced tumor necrosis factor-α production[J].Journal of Microbiology and Biotechnology,2008,18(6):1191-1196.

[26]KIM H G,KIM N R,GIM M G,et al.Lipoteichoic acid isolated fromLactobacillusplantaruminhibits lipopolysaccharide-induced TNF-α production in THP-1 cells and endotoxin shock in mice[J].The Journal of Immunology,2008,180(4):2553-2561.

(责任编辑菅景颖)

Teichoic Acid from Bacteria in Immune Regulation and Its Relationship to Structure

GAO Quanxin1PENG Shiming1ZHANG Chenjie1YAO Zhen2ZHANG Hui3SHI Zhaohong1*

(1.Key Laboratory of East China Sea and Oceanic Fishery Resources Exploitation, Ministry of Agriculture,East Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Shanghai 200090,China; 2. Dezhou Vocational and Technical College, Dezhou 253034, China; 3. Veterinary Station of Dagang, Agricultural Service Center of Binhai New Area of Tianjin,Tianjin 300270, China)

Abstract:Teichoic acid is one of the major components of cell wall of Gram-positive bacteria, and plays important roles in pathogenic bacteria-induced inflammation and immune regulation of probiotics and has a variety of physiological functions of bacteria, which has become the hotspot of the research today. The roles of teichoic acid of pathogenic and probiotic bacteria in immune stimulation and regulation, the effects of knockout of teichoic acid gene on bacteria, structure of teichoic acid and its relationship to function were reviewed and summarized. This review will supply new clues for further study and application of teichoic acid.[Chinese Journal of Animal Nutrition, 2016, 28(1)：15-19]

Key words:teichoic acid; immune regulation; structure

*Corresponding author, professor, E-mail: shizhh@hotmail.com

中图分类号：S917.1

文献标识码：A

文章编号：1006-267X(2016)01-0015-05

作者简介：高权新(1982—)，男，山东淄博人，助理研究员，博士，主要从事海水鱼类养殖研究。E-mail： gaoqx2008@163.com*通信作者：施兆鸿，研究员，硕士生导师，E-mail： shizhh@hotmail.com

基金项目：国家自然科学基金项目(31502206)；中央级公益性科研院所基本科研业务费(东2014Z02-2)

收稿日期：2015-07-01

doi：10.3969/j.issn.1006-267x.2016.01.003