布鲁菌sRNA研究进展

董　浩,彭小薇,赵柏林,孙　雨,曲　萍,王晓英,胡冬梅,石　慧,宋晓晖*

(1.中国动物疫病预防控制中心,北京 102600；2.中国兽医药品监察所，北京 100081)



布鲁菌sRNA研究进展

董浩1,彭小薇2,赵柏林1,孙雨1,曲萍1,王晓英1,胡冬梅1,石慧1,宋晓晖1*

(1.中国动物疫病预防控制中心,北京 102600；2.中国兽医药品监察所，北京 100081)

布鲁菌病是一种危害严重的人兽共患病，威胁着畜牧业的发展和人类的公共卫生安全。作为布鲁菌病的病原，布鲁菌能够耐受宿主体内的各种杀菌机制并持续的生存。细菌的sRNA在基因组中被转录，但绝大多数sRNA并不编码蛋白质。sRNA通过碱基配对与mRNA结合，影响mRNA的稳定性或翻译，从而调控细菌代谢、群体感应、环境应激及细菌毒力基因表达等生物过程。通过sRNA调控毒力相关基因表达，使布鲁菌可以耐受多种胞内应激环境。目前为止，仅有少数布鲁菌sRNA的功能得到了较全面的研究，论文对这些sRNA的研究进展进行综述。

布鲁菌；sRNA；基因表达；毒力基因

布鲁菌作为一种兼性的胞内寄生菌，可以在专业和非专业的吞噬细胞内生存。当布鲁菌侵入宿主细胞后，面临着恶劣的生存环境(酸性、强氧化性、高渗透压和营养缺乏等)[1]。为了适应这些外部的应激环境，布鲁菌必须在转录起始、转录后、翻译等不同层次上对自身基因的表达进行调控。目前，在布鲁菌中转录起始水平的调控已经进行了非常广泛的研究，然而转录后(比如sRNA)及翻译水平的研究至今仍不多见。

生物体中存在大量的非编码RNA(non-coding RNA，也叫small RNA，sRNA)，隐藏在基因组内，有学者称之为基因组内的“暗物质”，不可见却发挥着调控基因表达的重要功能。sRNA在细菌、古生菌和真核生物体中广泛的存在。起初，sRNA的研究主要集中于真核生物，后来才渐渐把注意力转移到原核生物，尤其是病原细菌[2-3]。

1　细菌sRNA的简介

1.1细菌sRNA发现的历史

由于非编码RNA在转录后通常并不翻译为蛋白质，许多年来一直被认为其不具备生物学功能。直到1967年，通过标记大肠埃希菌体内所有的RNA，在聚丙烯酰胺凝胶上探测到由大肠埃希菌基因ssrS所编码的一种新的数量较多的RNA分子，从而发现了细菌的首个非编码RNA-6SRNA[4]。1984年，在大肠埃希菌中鉴定了第1个染色体编码的sRNA，MicF(174核苷酸)，其可以抑制OmpF mRNA的转录[5]。2000年，通过传统方法(例如聚丙烯酰胺凝胶电泳分离)已经发现了13个sRNA。其中，RprA、MicF、DicF及DsrA是作为基因片段被发现的；GcvB和OxyS是在探查基因时偶然被发现的；而Spot42、10Sa(tmRNA)和10Sb等则是通过磷酸化标记所有的RNA后发现的,但是它们的生理功能直到30年后才被阐明[6]。2001年， 由于应用生物信息学方法分析基因组基因间区域及研发了一些新的检测技术，如比较基因组学、基因芯片、RNA组学和深度测序，在全基因组水平上验证出了许多细菌的新的sRNA，包括大肠埃希菌、枯草芽胞杆菌、 绿脓假单胞菌、金黄色酿脓葡萄球菌和单核细胞增多性李斯特菌[7]。2011年，发现了一个反式编码的sRNA-tracrRNA，其通过24个核苷酸序列与CRISPR RNAs(crRNA)前体转录单元的重复序列配对从而促进crRNA的成熟，首次揭示了sRNA参与细菌RNA介导的免疫反应[8]。时至今日，鉴定出的大肠埃希菌的sRNA已经超过80个。而从sRNA的数据库sRNAMap可以得知，现已经发现900多个sRNA，它们大多数位于基因间隔区中[9]。

1.2sRNA的主要特征

细菌的sRNA具有以下特征：①其长度一般介于40 nt～500 nt之间，长于真核生物中成熟的miRNA；②其大部分位于间隔区(IGR)中，少部分位于3′UTR或5′UTR(例如RyeB和SraC/RyeA)；③通过多种试验方法和生物信息学方法发现，sRNA除了分布在核心基因组中，有些sRNA甚至位于插入序列、质粒、噬菌体和致病岛上；④1个sRNA可调节多个靶mRNA，一个靶mRNA也可能受多个sRNA调节；⑤大多数sRNA是通过与RNA结合蛋白以复合物形式发挥作用[10]。

1.3sRNA的分类

1.3.1根据位置分类基于在基因组上的位置，sRNA可以分为顺式编码sRNA(cis-acting sRNA)及反式编码sRNA(trans-encoded sRNA)。顺式编码sRNA位于靶mRNA的DNA互补链上，通过直接与靶序列的互补配对发挥作用；而反式编码sRNA与配对靶mRNA有一定的距离，通常只存在唯一互补的靶点[11]。

大多数顺式编码的反义RNA位于质粒、噬菌体和转座子中，也在细菌染色体中发现了一部分顺式编码的RNA[12]。在细菌里，顺式编码是sRNA与它们互作的靶mRNA进行碱基反向配对，通常导致了对靶mRNA的负调控作用，包括复制起始、接合效率、自杀、转座、mRNA降解及翻译起始[13]。

反式编码的sRNA则位于细菌染色体上，对它们的靶mRNA则有可能起正调控或负调控的作用。大部分反式编码的sRNA可以同时调控多个靶点，有些甚至类似全局调控子对许多细胞生理活动做出反应[14]。

1.3.2根据生物学及作用机制分类根据sRNA的生物学及作用机制，可以将其分为三类。

(1) 具有特殊活性的sRNA 行使管家功能的sRNA，它们的表达水平通常是很高的。目前发现这一类型的sRNA有3种，包括转移信使RNA(transfer messenger RNA或10 S sRNA)、具有酶催化活性且形成RNase P的催化亚单位MIRNA及组成核糖核蛋白(ribonueleoprotein，RNP)复合物4.5 S RNA。

(2) 与蛋白质相互作用从而影响蛋白质功能的sRNA 这类sRNA主要通过与蛋白质互作从而影响蛋白质的生物学功能，比如大肠埃希菌中第1个鉴定出来的6 S RNA，可以直接与σ70 RNA聚合酶互作并改变RNA聚合酶的活性，从而抑制启动子区域10 bp上游含TGn序列(TGnTATAAT)基因的转录。又如sRNA CsrB和CsrC可以与全局转录后调控因子CsrA蛋白互作形成调控反应回路。在此回路中，这两个sRNA作为CsrA蛋白的拮抗物，可通过与CsrA结合严格调控CsrA蛋白的活性。

(3) 与目的mRNA配对结合调控基因表达的sRNA这种调控模式是细菌sRNA发挥调控功能最普遍的形式之一。目前，发现的细菌sRNA大部分都属于这种类型。sRNAs同靶mRNA结合后，要么促进或抑制靶点mRNA的翻译，例如sRNA分子Spot42和OxyS可以封闭靶mRNA的核糖体结合位点从而抑制靶基因的表达，DsrA和RprA同靶mRNA配对结合后能够暴露其核糖体结合位点从而促进目的基因翻译；要么减缓或加速靶mRNA的降解，例如RyhB主要作为转录后抑制子影响靶基因sodB、sdhC、fumA mRNA的稳定性从而调节铁代谢[15]。

2　布鲁菌sRNA研究进展

有关布鲁菌sRNA的研究起步较晚，2010年王同坤等[16]通过生物信息学方法对羊种布鲁菌16M的sRNA进行了预测，共预测出22个假定编码sRNA的序列，并从中鉴定出1个sRNA BSR-2。通过荧光定量PCR检测该sRNA在△VirB缺失株和△vjbR缺失株中的转录水平，发现在上述2种缺失株中BSR-2的转录水平均明显下降，由于VirB和VjbR是布鲁菌Ⅳ型分泌系统和布鲁菌密度感应系统中2个重要的毒力因子，提示其可能与布鲁菌胞内生存相关。

Caswell C C等[17]在2012年通过比较牛种布鲁菌2308 hfq缺失株和野生株的转录谱，发现了2个与土壤农杆菌同源的sRNA AbcR1和AbcR2。这2个sRNA存在功能上的冗余，在牛种布鲁菌2308中单独缺失任意1个sRNA不能影响细菌毒力，只有同时缺失2个sRNA才会引起细菌在巨噬细胞及小鼠体内毒力下降。进一步研究表明，AbcR sRNA可能通过加速靶mRNA的降解影响了氨基酸和聚胺的转运和代谢过程从而影响细菌的致病性。

随着生物信息学的发展，根据已经发现的细菌sRNA的特征，出现了多种预测sRNA的生物信息学方法。2014年，作者所在的研究团队综合了SIPHT和NAPP 2个预测sRNA的生物信息学方法，在牛种布鲁菌2308株中预测出129个假定的sRNA，通过反转录PCR对其中20个假定的sRNA进行验证，成功鉴定出7个sRNA。在进一步的研究中，采用Starpicker软件对经过验证的7个sRNA靶点进行了预测，并通过大肠埃希菌双质粒系统对预测结果进行了验证。结果显示，Starpicker软件对7个sRNA的靶点预测有4个是正确的[18]，这表明通过这种生物信息学方法对细菌sRNA的预测是确实可行的，并具有较高的准确性。除此之外，Peng X等[19]对上述预测结果进行了进一步分析，发现了1个顺式表达的sRNA-BsrH，该sRNA直接调控着布鲁菌铁代谢相关基因hemH的表达，并且与布鲁菌耐受缺铁环境密切相关。

最近，Wang Y等[20]结合生物信息学和试验方法在羊种布鲁菌16M中验证了8个新的sRNA，并发现其中的1个sRNA BSR0602在稳定期、应激环境、感染巨噬细胞及小鼠时表达显著上升，过表达BSR0602的菌株在细胞模型和小鼠模型中毒力降低，故认为BSR0602可能与细菌适应应激环境和毒力机制相关。这是继上述研究之后再次发现的与细菌应激及毒力相关的sRNA。

随着高通量测序技术的发展，使得在全基因组范围内鉴定细菌的sRNA成为可能。Saadeh B等[21]采用转录组测序技术对布鲁菌的sRNA进行了研究，结果鉴定出了33个可以与Hfq蛋白相互结合的sRNA。通过Northern blot和反转录PCR技术对转录组测序结果进行验证，结果显示10个在稳定期早期表达的sRNA得到了验证。

3　展望

在其他细菌中的研究已经表明，sRNA通过调控靶基因的表达，影响细菌对外界环境的耐受能力，调控毒力相关基因的表达。与其他细菌相比，布鲁菌sRNA的研究才刚刚起步。作者所在研究团队也在早期工作的基础上，对sRNA的预测结果进行了全面验证，发现了超过40个sRNA并对其表达特性、调控功能、与布鲁菌毒力的相关性进行了初步的研究，发现某些sRNA的不正常表达会显著影响布鲁菌的毒力(文章未发表)。从当前布鲁菌sRNA的研究进展看，越来越多的证据也表明sRNA与布鲁菌的毒力密切相关，因此作者深信对布鲁菌sRNA功能的研究对揭示其致病机制和攻克布鲁菌病治疗难题都具有重要意义。

[1]董浩，吴清民.布鲁菌二元调控系统研究进展[J].动物医学进展,2013,34(8):80-83.

[2]董浩，牛慧，彭小薇，等.布鲁菌Hfq蛋白研究进展[J].动物医学进展,2016,37(1):93-95.

[3]赵小凯，竹俊兰，严浩，等.细菌sRNA功能、预测及鉴定方法的研究进展[J].温州医学院学报,2012,42(5):503-507.

[4]Hindley J.Fractionation of 32P-labelled ribonucleic acids on polyacrylamide gels and their characterization by fingerprinting[J].J Mol Biol,1967,30(1):125-136.

[5]Mizuno T,Chou M Y,Inouye M. A unique mechanism regulating gene expression:translational inhibition by a complementary RNA transcript (micRNA)[J].Proc Natl Acad Sci U S A ,1984,81(7):1966-1970.

[6]王晨红，李春更，李洪涛.大肠杆菌sRNA的研究进展[J].河北北方学院学报:医学版，2009,26(4):80-82.

[7]Kang Z,Zhang C,Zhang J,et al.Small RNA regulators in bacteria:powerful tools for metabolic engineering and synthetic biology[J].Appl Microbiol Biotechnol,2014,98(8):3413-3424.

[8]Deltcheva E,Chylinski K,Sharma C M,et al.CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III[J].Nature,2011,471(7340):602-607.

[9]Li W,Ying X,Lu Q,et al.Predicting sRNAs and their targets in bacteria[J].Genomics Proteomics Bioinformatics,2012,10(5):276-284.

[10]唐彬,肖斌,毛旭虎,等.细菌中非编码小RNA的筛选及鉴定[J].生命的化学,2008,28(4):477-480.

[11]Hoe C H,Raabe C A,Rozhdestvensky T S,et al.Bacterial sRNAs:regulation in stress[J].Int J Med Microbiol,2013,303(5):217-229.

[12]Brantl S.Regulatory mechanisms employed by cis-encoded antisense RNAs[J].Curr Opin Microbiol,2007,10(2):102-109.

[13]Dadzie I,Ni B,Gong M,et al.Identification and characterization of a cis antisense RNA of the parC gene encoding DNA topoisomerase IV ofSalmonellaentericaserovartyphi[J].Res Microbiol,2014,165(6):439-446.

[14]Richards G R,Vanderpool C K.Molecular call and response:the physiology of bacterial small RNAs[J].Biochim Biophys Acta,2011,1809(10):525-531.

[15]聂佳佳，金鑫，孟宪臣，等.细菌非编码小RNA 的分类及功能简介[J].中国动物传染病学报,2013(3):75-79.

[16]王同坤，王立贵，陈泽良，等.羊布鲁氏菌非编码小RNA分子BSR-2的预测与鉴定[J].中国生物化学与分子生物学报,2010,26(10):923-929.

[17]Caswell C C,Gaines J M,Ciborowski P,et al.Identification of two small regulatory RNAs linked to virulence inBrucellaabortus2308[J].Mol Microbiol,2012,85(2):345-360.

[18]Dong H,Peng X W,Wang N,et al.Identification of novel sRNAs inBrucellaabortus2308[J].FEMS Microbiol Lett,2014,354(2):119-125.

[19]Peng X,Dong H.,Wu Q. A new cis-encoded sRNA,BsrH,regulating the expression of hemH gene inBrucellaabortus2308[J].FEMS Microbiol Lett,2015,362(2):1-7.

[20]Wang Y,Ke Y,Xu J,et al.Identification of a novel small non-coding RNA modulating the intracellular survival ofBrucellamelitensis[J].Front Microbiol,2015,6:164.

[21]Saadeh B,Caswell C C,Chao Y,et al.Transcriptome-wide identification of Hfq-associated RNAs inBrucellasuisby deep sequencing[J].J Bacteriol,2015,198(3):427-435.

Progress on Brucella sRNA

DONG Hao1,PENG Xiao-wei2,ZHAO Bo-lin1,SUN Yu1,QU Ping1,WANG Xiao-ying1,HU Dong-mei1,SHI Hui1,SONG Xiao-hui1

(1.China Animal Disease Control Center,Beijing,102600,China; 2.China Institute of Veterinary Drug Control,Beijing,100081,China)

Brucellosis is a serious zoonosis,which threatens the development of animal husbandry and human public health.As the pathogen of brucellosis,Brucellacan resist various bactericidal mechanisms and persist for a long time in the host cells.sRNAs can be transcripted from the bacterial genomes,while most of sRNAs do not encode proteins.Bacterial sRNAs affect stability or translation of mRNAs by base-pairing with their targets,resulting in regulating various biological processes,such as bacterial metabolism,quorum sensing,stress responses,and the expression of bacterial virulence genes.The sRNAs regulate the expressions of virulence related genes,which can make the pathogen resist to various intracellular stress environment.At present,only few number ofBrucellasRNAs have been studied comprehensively,and in this review we summarized the recent research progress onBrucellasRNAs.

Brucella; sRNA; gene expression; virulence gene

2016-01-31

董浩(1985-)，男，山东威海人，博士，主要从事人畜共患病防控技术相关研究。*通讯作者

S852.614

A

1007-5038(2016)08-0091-04