微小RNA在肝纤维化中作用的研究进展

程 丹 汤绍迁

微小RNA在肝纤维化中作用的研究进展

程 丹 汤绍迁

微小RNA(miRNA)是一类长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子，是调控蛋白质生物合成的一类重要的非编码RNA。关于miRNA在肝纤维化中的作用一直是近年来的研究热点。已有研究发现，miRNA在肝纤维化的发生发展中存在异常表达，并在调控肝纤维化相关的信号通路和肝星状细胞(HSC)的增殖、分化和凋亡中起重要作用。此文就近年来有关miRNA在肝纤维化中作用的研究进展作一综述。

肝纤维化；miRNA；肝星状细胞

肝纤维化是由各种病因(肝炎病毒、乙醇、血吸虫及药物等)所致的慢性肝损伤的共同病理改变，是慢性肝病进展为肝硬化的必经阶段。各种致病因素会引发肝细胞损伤、坏死及炎性反应，激活肝脏内的巨噬细胞(如库普弗细胞)，并分泌肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、转化生长因子-β(TGF-β)、白细胞介素-1β(IL-1β)和IL-6等多种细胞因子，共同作用于肝星状细胞(HSC)，促使HSC转变为活化的HSC，即肌成纤维细胞(MFB)，MFB加速了细胞外基质(ECM)蛋白[包括α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、胶原蛋白、基质金属蛋白酶抑制剂-1(TIMP-1)和肌间线蛋白]的合成与沉积，并最终导致肝纤维化[1]。随着对肝纤维化病理的深入认识，现认为肝纤维化是可以逆转的，甚至连肝硬化在某些情况下也是有可能逆转的[2]，并且这种逆转已经在由乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒以及其他原因所导致的肝硬化患者中观察到[3-4]。 但是，由于肝纤维化的过程不易被察觉，以至于多数患者发现时已进展为肝硬化，加大了治疗的难度。因此，如何在早期及时、有效地诊断肝纤维化，对于众多肝病患者而言具有重大意义。

近年来研究发现，微小RNA(miRNA)可参与并调节肝纤维化的进程，在HSC的激活及肝纤维化相关信号通路中发挥着重要作用。Zhang等[5]收集了慢性乙型肝炎和肝硬化患者的血浆，通过miRNA微阵列检测不同分组的循环miRNA的表达量，发现了12种在所有分组中均出现异常表达的miRNA，包括10种上调的miRNA以及2种下调的miRNA。有关miRNA在肝纤维中的作用已成为近年来的研究热点。

1 miRNA 的合成及其作用机制

真核生物细胞内的miRNA主要有两种来源：大部分的miRNA可通过特定的基因转录加工而产生；另一小部分miRNA可以从内含子或长链非编码RNA(lncRNA)中产生。许多miRNA都具有自身的独立基因，通过RNA聚合酶Ⅱ(RNase Ⅱ)转录产生特异性的转录产物，这是miRNA产生的经典途径。在RNase Ⅱ的催化作用下，转录产生初级前体miRNA(pri-miRNA)，然后经过5′-端加帽，3′-端加poly A尾[6]。pri-miRNA 在RNase Ⅲ(Drosha)的催化下与双链RNA结合蛋白DGCR8形成Drosha-DGCR8复合物，将pri-miRNA加工成一个约70 nt，含有发卡结构的前体，称为pre-miRNA[7]。pre-miRNA被随机转运至胞质中，在RNase Ⅲ(Dicer)催化下与双链RNA结合蛋白TRBP结合形成复合物，在TRBP协助下，Dicer将pre-miRNA进一步裂解产生一个20 bp的miRNA/miRNA*双链分子[8]。加工产生的短双链RNA中的一条将与AG01/AG02结合并留在RISC中形成miRNA诱导的沉默复合体(miRISC)，从而行使miRNA的功能，而另一条链则被释放降解。

miRNA的主要功能是在翻译水平调控蛋白质编码基因的表达，且以负调控作用为主。miRNA调控基因表达主要是通过miRNA以不完全互补的方式引导miRISC结合靶mRNA，与靶mRNA的3′-非翻译区(UTR)结合并阻止其翻译；如果miRNA与mRNA的靶序列完全互补，则通过miRISC中的AG02发挥内切核酸酶作用，促进其降解[9-10]。

2 miRNA参与HSC的活化、增殖和凋亡

HSC的激活是肝纤维化的关键环节，也是肝纤维化的主要效应细胞[1,11]，近年来体外及体内的研究表明，miRNA在HSC的激活中起着重要作用。

2.1 miRNA调节HSC活化

近期一项研究发现，在肝硬化患者和硫代乙酰胺(TAA)或 四氯化碳(CCl4)诱导的小鼠纤维化模型的肝组织中，miR-21均呈高水平表达；下调miR-21和活化蛋白-1(AP-1)的表达后可观察到HSC的活化显著受到抑制，纤维化的程度则得以缓解；相反，用小干扰RNA抑制程序性细胞凋亡因子4(PDCD4)的表达后，则可以促进HSC向成纤维细胞转变，加速肝纤维化的进程，提示miR-21可通过miR-21/PDCD4/AP-1反馈回路维持其在肝纤维化过程中的高表达水平，并促进 HSC的活化[12]。Maubach等[13]通过体内及体外的研究发现，与处于静态的HSC相比较，激活后10 d的HSC中有16种miRNA表达上调及26种miRNA表达下调。Lakner等[14]通过miRNA微阵列分析对比处于活化和未活化状态下HSC中miRNA的表达量，发现miR-34c、miR-184和miR-221的表达显著上调，而另有8种miRNA(miR-16、miR-19a、miR-19b、miR-29a、miR-29c、miR-92a、miR-150和miR-194)的表达则显著下调。Yan等[15]检测了HSC处于绝对静态的前3 d及激活后10 d的miR-34a和转录因子ACSL1的表达量，以及miR-34a沉默后HSC中ACSL1的表达量，发现miR-34a可能是通过直接靶向调节ACSL1的表达而参与肝纤维化进程。

2.2 miRNA调节HSC的凋亡

Zheng等[16]通过基因微阵列发现miR-150在肝纤维化中的表达显著降低，而在LX-2细胞株中高表达miR-150会抑制细胞的增殖，并减少ECM以及α-SMA的生成，提示miR-150在调节HSC的凋亡，抑制肝纤维化中起着重要作用。Dai等[17]的体外实验研究显示，在肝硬化患者的肝组织、血清以及活化的HSC中均发现miR-155的表达降低，而在高表达miR-155后发现HSC的凋亡显著增加，并且抑制了上皮间质转化(EMT)以及细胞外调节蛋白激酶(ERK1)信号通路的活性。在大鼠肝纤维化组织中，miR-150和miR-194同样被发现在HSC中表达降低，而使其过表达后则会显著抑制HSC的增殖，并减少α-SMA和Ⅰ型胶原蛋白的生成[18]。Wang等[19]通过体外实验证实，miR-29在LX-2 HSC、LX-1以及HSC-T6细胞株中高表达后，会显著抑制HSC的增殖并促进其凋亡。

3 miRNA在肝纤维化相关信号通路中的作用

目前研究表明，肝纤维化是一个复杂的病理变化过程，受到多种信号通路及细胞因子的调节，包括TGF-β/Smad、磷脂酰肌醇3 激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、核因子-κB(NF-κB)以及Wnt/β-catenin等信号通路。

3.1 miRNA在TGF-β/Smad通路中的作用

TGF-β具有多种生物学作用，可参与细胞增殖、分化、凋亡、ECM沉积及ECM蛋白的合成和降解，是调控机体器官纤维化的核心通路[20]，其中TGF-β1/Smad信号转导通路是调节ECM基因表达以及促进ECM生成的重要途径[21-22]。Tu等[23]通过对大鼠肝纤维化模型的研究发现，miR-101可以抑制TGF-βⅠ型(TβRⅠ)在肝细胞和HSC中的表达，从而阻断TGF-β信号通路在肝纤维化中的作用，进而促进活化的HSC逆转为静态的HSC；同时，在人肝细胞中，miR-101也可以通过阻止TGF-β信号通路的转导而抑制肝纤维化相关细胞因子的释放。Lakner等[14]研究发现，将大鼠活化的HSC中miR-19b的表达水平提高后，TGF-β通路中的组成成分TGF-βⅡ型受体(TβRⅡ)的表达量显著降低，同时降低了Ⅰ型胶原蛋白的表达以及TGF-β介导的α1和α2型胶原蛋白mRNA的表达，表明miR-19b可以抑制HSC中的TGF-β信号通路的活性。Roy等[24]在研究miR-30c和miR-193在肝纤维化中的作用时发现，TGF-β2和Snail1(调控ECM的关键因子)可能是miR-30c和miR-193的两个作用靶点。

3.2 miRNA在PI3K/Akt通路中的作用

PI3K/Akt通路是一条经典的信号转导途径，在肝纤维化发展过程中发挥着重要的调节作用，通过调节ECM的降解，可影响HSC的增殖和凋亡，参与肝纤维化的形成[25]。Wang等[19]将miR-29b转导入CCl4诱导的小鼠肝纤维化模型中并使其高表达后，发现miR-29b可调控半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9(caspase-9)并诱导HSC凋亡，且miR-29b可通过直接结合PIK3R1和Akt3的3′端UTR区域而抑制PI3K/Akt的信号转导。进一步研究发现，在敲除了PIK3R1或Akt3基因后会抑制α-SMA和Ⅰ型胶原蛋白的表达并诱导HSC的凋亡，表明miR-29b可以通过抑制PI3K/Akt信号通路，阻止HSC的激活并诱导其凋亡，在肝纤维化的发生发展中起重要作用。Xiao等[26]在研究miR-200b在人HSC系LX-2中的作用时发现，miR-200b可以提高Akt的磷酸化水平，用miR-200b模拟物(miR-200b mimic) 使其高表达后发现FOG2(miR-200b的靶蛋白，可以抑制PI3K/Akt通路的活化)的表达水平显著降低，表明miR-200b可通过下调FOG2而激活PI3K/Akt通路，进而刺激HSC的生长和迁徙。Wei等[27]在研究miR-21在人HSC系LX-2中的作用时发现，上调miR-21的表达会刺激LX-2的增殖；相反，下调miR-21的表达则会抑制LX-2的增殖，同时发现miR-21的高表达会抑制LX-2细胞中PTEN蛋白的表达，进而激活Akt蛋白，而用miR-21的抑制剂LY294002抑制Akt信号通路后，可以阻止LX-2细胞的纤维化，表明miR-21可以通过调节PI3K/Akt信号转导通路而影响LX-2细胞的纤维化进程。

3.3 miRNA在NF-κB通路中的作用

NF-κB能通过调控多种炎性因子以及抗炎因子的表达来影响肝脏炎性反应的损伤修复，从而调节肝纤维化的发生发展；同时，NF-κB还能通过影响HSC的凋亡而参与肝纤维化的进程[28-29]。Feng等[30]研究了miR-126在LX-2细胞系中的作用机制，利用miR-126类似物或抑制剂上调或下调miR-126表达后，观察NF-κB蛋白、NF-κB抑制剂α(IκBα)的mRNA和蛋白的表达量以及NF-κB通路的下游信号分子TGF-β1和Ⅰ型胶原蛋白mRNA的表达量，最终发现miR-126可以抑制IκBα的表达；相反，敲除miR-126基因则会上调IκBα的表达并抑制NF-κB信号通路的激活，进而影响肝纤维化的进程。Hyun等[31]在CCl4诱导的小鼠肝纤维化模型研究中发现，miR-378a-3p的表达明显降低，将miR-378a-3p过表达后会显著抑制HSC的活性；使用Smoothened激活NF-κB p65及其信号通路后，发现miR-378a-3p的表达明显降低，表明miR-378a-3p在NF-κB信号通路的调控下可以影响HSC的活化，进而参与肝纤维化。

4 小结与展望

近年来随着对肝纤维化研究的深入，miRNA在肝纤维化进展、HSC活化和凋亡以及其相关信号通路中的作用越来越明确，这为肝纤维化患者的诊断及治疗提供了新的靶点，具有十分重要的临床意义。但目前仍有许多问题亟待解决，比如之前的研究大多局限于体外实验，如何在早期有效诊断肝纤维化，miRNA能否作为一个早期诊断肝纤维化的生物学指标，这些问题都需要进一步的深入研究。相信随着临床试验的进展，终究会克服肝纤维化诊断及治疗方面的难题。

1 Trautwein C, Friedman SL, Schuppan D, et al. Hepatic fibrosis: concept to treatment[J]. J Hepatol, 2015, 62: S15-S24.

2 Lee YA, Wallace MC, Friedman SL. Pathobiology of liver fibrosis: a translational success story[J]. Gut, 2015, 64: 830-841.

3 Marcellin P, Gane E, Buti M, et al. Regression of cirrhosis during treatment with tenofovir disoproxil fumarate for chronic hepatitis B: a 5-year open-label follow-up study[J]. Lancet, 2013, 381: 468-475.

4 D′Ambrosio R, Aghemo A, Rumi MG, et al. A morphometric and immunohistochemical study to assess the benefit of a sustained virological response in hepatitis C virus patients with cirrhosis[J]. Hepatology, 2012, 56: 532-543.

5 Zhang Q, Xu M, Qu Y, et al. Analysis of the differential expression of circulating microRNAs during the progression of hepatic fibrosis in patients with chronic hepatitis B virus infection[J]. Mol Med Rep, 2015, 12: 5647-5654.

6 Cai X, Hagedorn CH, Cullen BR. Human microRNAs are processed from capped, polyadenylated transcripts that can also function as mRNAs[J]. RNA, 2004, 10: 1957-1966.

7 Ruby JG, Jan CH, Bartel DP. Intronic microRNA precursors that bypass Drosha processing[J]. Nature, 2007, 448: 83-86.

8 Lee Y, Ahn C, Han J, et al. The nuclear RNase Ⅲ Drosha initiates microRNA processing[J]. Nature, 2003, 425: 415-419.

9 Lim LP, Lau NC, Garrett-Engele P, et al. Microarray analysis shows that some microRNAs downregulate large numbers of target mRNAs[J]. Nature, 2005, 433: 769-773.

10 Bartel DP. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function[J]. Cell, 2004, 116: 281-297.

11 Kitano M, Bloomston PM. Hepatic stellate cells and microRNAs in pathogenesis of liver fibrosis[J]. J Clin Med, 2016, 5: E38.

12 Zhang Z, Zha Y, Hu W, et al. The autoregulatory feedback loop of microRNA-21/programmed cell death protein 4/activation protein-1 (MiR-21/PDCD4/AP-1) as a driving force for hepatic fibrosis development[J]. J Biol Chem, 2013, 288: 37082-37093.

13 Maubach G, Lim MC, Chen J, et al. miRNA studies ininvitroandinvivoactivated hepatic stellate cells[J]. World J Gastroenterol, 2011, 17: 2748-2773.

14 Lakner AM, Steuerwald NM, Walling TL, et al. Inhibitory effects of microRNA 19b in hepatic stellate cell-mediated fibrogenesis[J]. Hepatology, 2012, 56: 300-310.

15 Yan G, Li B, Xin X, et al. MicroRNA-34a promotes hepatic stellate cell activation via targeting ACSL1[J]. Med Sci Monit, 2015, 21: 3008-3015.

16 Zheng J, Lin Z, Dong P, et al. Activation of hepatic stellate cells is suppressed by microRNA-150[J]. Int J Mol Med, 2013, 32: 17-24.

17 Dai W, Zhao J, Tang N, et al. MicroRNA-155 attenuates activation of hepatic stellate cell by simultaneously preventing EMT process and ERK1 signalling pathway[J]. Liver Int, 2015, 35: 1234-1243.

18 Venugopal SK, Jiang J, Kim TH, et al. Liver fibrosis causes downregulation of miRNA-150 and miRNA-194 in hepatic stellate cells, and their overexpression causes decreased stellate cell activation[J]. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 2010, 298: G101-G106.

19 Wang J, Chu ES, Chen HY, et al. microRNA-29b prevents liver fibrosis by attenuating hepatic stellate cell activation and inducing apoptosis through targeting PI3K/AKT pathway[J]. Oncotarget, 2015, 6: 7325-7338.

20 Lee JH, Lee H, Joung YK, et al. The use of low molecular weight heparin-pluronic nanogels to impede liver fibrosis by inhibition the TGF-β/Smad signaling pathway[J]. Biomaterials, 2011, 32: 1438-1445.

21 俞蕾敏, 吕宾. TGF-βsmad信号转导通路与肝纤维化的关系[J]. 国际消化病杂志, 2008, 28: 397-400.

22 Xu F, Liu C, Zhou D, et al. TGF-beta/SMAD pathway and its regulation in hepatic fibrosis[J]. J Histochem Cytochem, 2016, 64: 157-167.

23 Tu X, Zhang H, Zhang J, et al. MicroRNA-101 suppresses liver fibrosis by targeting the TGF-β signalling pathway[J]. J Pathol, 2014, 234: 46-59.

24 Roy S, Benz F, Vargas Cardenas D, et al. miR-30c and miR-193 are a part of the TGF-β-dependent regulatory network controlling extracellular matrix genes in liver fibrosis[J]. J Dig Dis, 2015, 16: 513-524.

25 Matsuda S, Kobayashi M, Kitagishi Y. Roles for PI3K/AKT/PTEN pathway in cell signaling of nonalcoholic fatty liver disease[J]. ISRN Endocrinol, 2013, 2013: 472432.

26 Xiao Y, Wang J, Chen Y, et al. Up-regulation of miR-200b in biliary atresia patients accelerates proliferation and migration of hepatic stallate cells by activating PI3K/Akt signaling[J]. Cell Signal, 2014, 26: 925-932.

27 Wei J, Feng L, Li Z, et al. MicroRNA-21 activates hepatic stellate cells via PTEN/Akt signaling[J]. Biomed Pharmacother, 2013, 67: 387-392.

28 陈科全, 周宇. 核因子NF-κB与肝纤维化的关系研究现状[J]. 国际消化病杂志, 2007, 27: 9-12.

29 Shu M, Huang DD, Hung ZA, et al. Inhibition of MAPK and NF-κB signaling pathways alleviate carbon tetrachloride (CCl4)-induced liver fibrosis in Toll-like receptor 5 (TLR5) deficiency mice[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2016, 471: 233-239.

30 Feng X, Tan W, Cheng S, et al. Upregulation of microRNA-126 in hepatic stellate cells may affect pathogenesis of liver fibrosis through the NF-κB pathway[J]. DNA Cell Biol, 2015, 34: 470-480.

31 Hyun J, Wang S, Kim J, et al. MicroRNA-378 limits activation of hepatic stellate cells and liver fibrosis by suppressing Gli3 expression[J]. Nat Commun, 2016, 7: 10993.

(本文编辑：周骏)

434020 湖北荆州，长江大学第二临床医学院 荆州市中心医院消化内科

汤绍迁，Email: jz-tsq@163.com

10.3969/j.issn.1673-534X.2016.06.004

2016-06-12)