诱导多能干细胞在皮肤病研究的应用进展

吴瑾 杨春生 周武军

·综述·

诱导多能干细胞在皮肤病研究的应用进展

吴瑾 杨春生 周武军

诱导多能干细胞是将一系列转录因子转入动物或人多种分化成熟的体细胞，经过重组的程序诱导获得多能干细胞，其在形态、增殖能力、表面抗原、基因和蛋白表达、分化能力等方面与胚胎干细胞相似，因此，科研工作者利用诱导多能干细胞代替胚胎干细胞来研究皮肤病。因诱导多能干细胞除具有多能性还具有无限增殖的能力，这些特性能使研究者获得无限的特定细胞，进而建立遗传性皮肤病模型。将致病的突变基因在诱导多能干细胞水平矫正，矫正后的诱导多能干细胞能产生基因正常的健康皮肤组织细胞，从而可望治疗遗传性皮肤病。

皮肤疾病；诱导多能干细胞；遗传；基因；治疗应用

诱导多能干细胞（iPS细胞）最初是2006年日本科学家Yamanaka等把八聚体结合转录因子4（Oct4）、性别决定区盒子2、髓细胞瘤病病毒癌基因同系物、Kruppel样因子4转录因子基因克隆入病毒载体，引入小鼠成纤维细胞使其重编程，进而发现可诱导其发生转化，产生的iPS细胞在形态、基因和蛋白表达、表观遗传修饰状态、类胚体和畸形瘤生成能力、分化能力等方面都与胚胎干细胞相似［1］。后来一系列研究还发现，除上述4种病毒整合载体外，Nanog和Lin28的病毒整合载体，以及Oct4，性别决定区盒子2，Kruppel样因子4和髓细胞瘤病病毒癌基因同系物的非整合病毒载体或质粒载体分别在小鼠和人多种分化细胞中成功诱导出iPS细胞。鼠和人的iPS细胞在细胞形态、分子标记和分化发育特点等方面与胚囊来源的胚胎干细胞有着相似的特征［2-3］。

作者单位：223002江苏省淮安市第二人民医院皮肤性病科

1 皮肤细胞诱导产生iPS细胞

获得iPS细胞最常见方式是通过小块皮肤组织的成纤维细胞（包括小鼠和人皮肤组织）经干细胞转录因子重组诱导获得。

2008 年，Lowry 等［4］报道了由患者个体组织培养获得的真皮成纤维细胞诱导得到患者特定的iPS细胞。2011 年，Huang等［5］发现，通过腺病毒介导的过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子过表达，可以是皮下脂肪细胞仅在Oct4/性别决定区盒子2/Kruppel样因子4诱导下获得iPS细胞，这减少了由髓细胞瘤病毒癌基因同系物引起的致癌风险。同年，Tsai等［6］发现，人毛乳头细胞几乎表达除了Oct4之外的所有重组因子，通过应用Oct4单种干细胞转录因子（Oct4）可将人毛乳头细胞诱导为iPS细胞，这在一定程度上减少了基因过表达引起突变的危险及危害。2015年，Hung等［7］通过简单的非创伤性方法（拔取头发）培养的角质形成细胞应用非整合型附着体载体诱导得到iPS细胞。由此可见，皮肤细胞尤其是拔发获得的毛乳头细胞及皮下脂肪细胞，是获得iPS细胞的诱导优势细胞，不仅取材方便，而且可以避免在成熟体细胞诱导过程中过多的表达干细胞转录因子，减少癌变的可能，有利于临床进一步应用。

2 iPS细胞诱导分化产生皮肤细胞

目前，已有研究者通过应用维A酸和成骨蛋白4改变iPS细胞的培养环境，将其定向分化为角质形成细胞［8-9］，这些细胞完整表达角质形成细胞标记物，如角蛋白14和末端蛋白63，并可通过荧光标记物抗体筛选出高纯度的角质形成细胞。iPS细胞定向分化的角质形成细胞在体外能形成完整的表皮组织，种植在免疫缺陷小鼠同样会产生完整的表皮。除角质形成细胞，其他的人皮肤组成细胞如黑素细胞及成纤维细胞均可以由iPS细胞定向分化获得［10-11］。将3种重要的皮肤细胞即角质形成细胞、成纤维细胞、黑素细胞混合培养有可能产出完整的功能性人皮肤组织。

除可以产生表皮，iPS细胞技术还能用于获得皮肤附属器。有研究证实，人iPS细胞来源的外胚层祖细胞在体内可以形成毛囊结构。他们将iPS细胞来源的外胚层祖细胞和鼠毛乳头细胞一起种植在免疫缺陷鼠，几周后发现形成了新的毛囊［12-13］。iPS细胞技术使得获得特定多潜能干细胞，并用于移植治疗且无免疫排斥成为可能。

iPS细胞通过一种重组程序而获得，这种重组程序能诱导一系列的干细胞转录因子进入成熟体细胞，如真皮成纤维细胞，从初始诱导到iPS细胞特定的克隆形态形成大约需14～21 d，这些克隆除具有多能性，其另一重要特征是其可以无限的增殖。因此，可以通过一小块皮肤组织标本就能获得无限的iPS细胞；然后又可将这些iPS细胞定向分化为各种类型的成体细胞。如将iPS细胞直接分化为表皮角质形成细胞。通过体外3D皮肤培养或体内异种移植至免疫缺陷小鼠培养技术，可以运用iPS细胞诱导获得角质形成细胞构建皮肤组织［14-15］。目前的技术还能使研究者通过iPS技术来纠正遗传性皮肤病中的基因突变，从而为基因遗传性皮肤病患者进行替代治疗。这种技术的一个重要优点是这种方法治疗后的患者不会出现免疫排斥反应。

3 iPS细胞结合基因编辑技术用于皮肤病的治疗

目前的研究已证实，iPS细胞的一个重要特性是其具有无限增殖的能力，可以模拟出各种人类遗传性皮肤病的疾病模型［14-15］。治疗人类遗传病的基本方案如下：①患者特定的iPS细胞可以由患者体细胞获得；②如果有基因缺陷可通过基因打靶技术纠正患者iPS细胞的缺陷基因；③纠正后的iPS细胞被直接分化为目的细胞；④纯化的目的细胞用于临床移植治疗。应用iPS细胞技术治疗遗传性皮肤病是从该患者身上获得基因突变的iPS细胞，通过基因纠正将iPS细胞定向分化为正常的皮肤组织细胞。这个过程中，基因突变须在体外纠正，可以通过特定序列DNA核苷酸来完成，设计这种核苷酸（如TALE核酸酶［16］）是为了切除特定的DNA序列。这些核苷酸通过包含正确DNA序列的质粒被诱导入患者细胞，即同源组合就能使引起疾病的点突变得到修正［14-15］。基因纠正后的iPS细胞会提供一个理想的细胞来源，通过定向分化可获得大量患者自身特定的（具有很好的免疫耐受性）健康皮肤的移植物，因此，这种基因纠正的方法可通过iPS细胞实现。Tolar等和Osborn等［17-18］两个研究组证实，可以从患有隐性遗传全身性营养不良性大疱性表皮松解症的患者获得基因突变的iPS细胞。隐性遗传全身性营养不良性大疱性表皮松解症是由COL7A1基因突变引起的，该基因编码胶原蛋白Ⅶ，导致皮肤水疱的形成。研究者先获得患者iPS细胞，进行基因纠正，然后由纠正后的iPS细胞定向分化获得角质形成细胞形成皮肤组织块，因此，研究者能提供充足的证据证实，通过iPS细胞技术能为隐性遗传全身性营养不良性大疱性表皮松解症患者获得大量临床正常表皮。

4 iPS 细胞的优缺点［19］

iPS细胞与胚胎干细胞在形态、基因和蛋白表达、表观遗传修饰状态、类胚体和畸形瘤生成能力、分化能力等方面均相似，因此，可以通过iPS细胞的无限增殖性等优势来研究正常人体的发育以及机体发生疾病的分子病理机制。然而，iPS细胞毕竟不等同于胚胎干细胞，在诱导以及体外培养过程中会出现各种问题。

4.1 iPS技术的优点：①iPS细胞可由少量的皮肤组织诱导获得；②iPS细胞在体外可以无限的增殖，提供大量的细胞来源；③iPS细胞可以分化为各种细胞类型；④由iPS细胞分化获得的细胞能用于疾病模型和药物筛选；⑤基因突变引起的皮肤病可以在iPS细胞中纠正突变基因；⑥由iPS细胞衍生而来的细胞如角质形成细胞可以用于细胞治疗；⑦应用iPS细胞分化的成体细胞避免了由胚胎干细胞引起的伦理问题。

4.2 iPS技术的缺点：①iPS细胞在体外重组培养的过程中可能会发生基因组的突变；②未分化的iPS细胞，如果输入患者体内会引起肿瘤（畸胎瘤）；③在临床应用之前，必须有标准化步骤来规范iPS细胞的产生、维持、分化等。

5 结语

研究者可以通过遗传性皮肤病患者来源的iPS细胞定向分化获得角质形成细胞，同时获得一些与基因突变引起的与疾病相一致的疾病模型系统，这个系统能在RNA、蛋白质及功能水平评估疾病。此外，这种方法能获得患者自身细胞基础的筛选系统，从而使患者的角质形成细胞缺陷获得矫正成为可能。从长远来看，这种技术能用于产生患者自身来源的、基因纠正后的皮肤组织细胞，从而可移植到iPS细胞来源的患者。因此，这可能会为基因遗传病，如皮肤疱病或皮肤变脆性疾病提供新的治疗方案。

［1］ Aoi T,Yae K,Nakagawa M,et al.Generation of pluripotent stem cells from adult mouse liver and stomach cells ［J］.Science,2008,321（5889）:699-702.DOI:10.1126/science.1154884.

［2］ Stadtfeld M,Maherali N,Breault DT,et al.Defining molecular cornerstones during fibroblast to iPS cell reprogramming in mouse［J］.Cell Stem Cell,2008,2（3）:230-240.DOI:10.1016/j.stem.2008.02.001.

［3］ Mikkelsen TS,Hanna J,Zhang X,et al.Dissecting direct reprogramming through integrative genomic analysis ［J］.Nature,2008,454（7200）:49-55.DOI:10.1038/nature07056.

［4］ Lowry WE,Richter L,Yachechko R,et al.Generation of human induced pluripotent stem cells from dermal fibroblasts ［J］.Proc Natl Acad Sci USA,2008,105 （8）:2883-2888.DOI:10.1073/pnas.0711983105.

［5］ Huang PI,Chou YC,Chang YL,et al.Enhanced differentiation of three-gene-reprogrammed induced pluripotent stem cells into adipocytes via adenoviral-mediated PGC-1α overexpression ［J］.Int J Mol Sci,2011,12 （11）:7554-7568.DOI:10.3390/ijms12117554.

［6］ Tsai SY,Bouwman BA,Ang YS,et al.Single transcription factor reprogramming of hair follicle dermal papilla cells to induced pluripotent stem cells ［J］.Stem Cells,2011,29 （6）:964-971.DOI:10.1002/stem.649.

［7］ Hung SS,Pébay A,Wong RC.Generation of integration-free human induced pluripotentstem cells using hair-derived keratinocytes ［J］.J Vis Exp,2015, （102）:e53174.DOI:10.3791/53174.

［8］ Itoh M,Kiuru M,Cairo MS,et al.Generation of keratinocytes from normal and recessive dystrophic epidermolysis bullosainduced pluripotent stem cells ［J］.Proc Natl Acad Sci USA,2011,108（21）:8797-8802.DOI:10.1073/pnas.1100332108.

［9］ Petrova A,Celli A,Jacquet L,et al.3DIn vitromodel of a functional epidermal permeability barrier from human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells ［J］.Stem Cell Reports,2014,2（5）:675-689.DOI:10.1016/j.stemcr.2014.03.009.

［10］Ohta S,Imaizumi Y,Okada Y,et al.Generation of human melanocytes from induced pluripotent stem cells ［J/OL］.PloS One,2011,6（1）:e16182.［2011-01-13］.http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0016182.DOI:10.1371/journal.pone.0016182.

［11］Itoh M,Umegaki-Arao N,Guo Z,et al.Generation of 3D skin equivalents fully reconstituted from human induced pluripotent stem cells （iPSCs）［J/OL］.PLoS One,2013,8 （10）:e77673.［2013-10-11］.http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0077673.DOI:10.1371/journal.pone.0077673.

［12］Veraitch O,Kobayashi T,Imaizumi Y,et al.Human induced pluripotent stem cell-derived ectodermal precursor cells contribute to hair follicle morphogenesisin vivo ［J］.J Invest Dermatol,2013,133（6）:1479-1488.DOI:10.1038/jid.2013.7.

［13］ Yang R,Zheng Y,Burrows M,et al.Generation of folliculogenic human epithelial stem cells from induced pluripotent stem cells［J］.Nat Commun,2014,5:3071.DOI:10.1038/ncomms4071.

［14］Koch PJ,Dinella J,Fete M,et al.Modeling AEC-new approaches to study rare genetic disorders ［J］.Am J Med Genet A,2014,164A（10）:2443-2454.DOI:10.1002/ajmg.a.36455.

［15］ Koster MI,Dinella J,Chen J,et al.Integrating animal models andin vitrotissue models to elucidate the role of desmosomal proteins in diseases［J］.Cell Commun Adhes,2014,21（1）:55-63.DOI:10.3109/15419061.2013.876015.

［16］ Miller JC,Tan S,Qiao G,et al.A TALE nuclease architecture for efficient genome editing ［J］.Nat Biotechnol,2011,29 （2）:143-148.DOI:10.1038/nbt.1755.

［17］ Tolar J,McGrath JA,Xia L,et al.Patient-specific naturally gene-reverted induced pluripotentstem cells in recessive dystrophic epidermolysis bullosa ［J］.J Invest Dermatol,2014,134（5）:1246-1254.DOI:10.1038/jid.2013.523.

［18］ Osborn MJ,Starker CG,McElroy AN,et al.TALEN-based gene correction for epidermolysis bullosa ［J］.Mol Ther,2013,21（6）:1151-1159.DOI:10.1038/mt.2013.56.

［19］ Dinella J,Koster MI,Koch PJ.Use of induced pluripotent stem cells in dermatological research［J］.J Invest Dermatol,2014,134（8）:e23.DOI:10.1038/jid.2014.238.

Application of induced pluripotent stem cells in studies of skin diseases

Wu Jin,Yang Chunsheng,Zhou Wujun.Department of Dermatovenereology,Second People′s Hospital of Huai'an,Huai'an 223002,Jiangsu,China

Induced pluripotent stem cells （iPSCs） are generated through a process termed“reprogramming”,in which a set of transcription factors were introduced into multiple mature animal or human somatic cells.Since iPSCs are similar to embryonic stem （ES） cells in morphology,proliferation,surface antigens,gene and protein expressions,differentiation potency and so on,they are used instead of ES cells to study skin diseases.In addition to pluripotency,iPSCs also have indefinite proliferative potential,and specific cells can be achieved indefinitely by using the potentials of iPSCs to establish models for genetic skin diseases.Furthermore,pathogenic mutations can be corrected in iPSCs,which can then be used to generate gene-corrected normal skin cells for the treatment of genetic skin diseases.

Skin diseases;Induced pluripotent stem cells;Heredity;Genes;Therapeutic uses

Zhou Wujun,Email:pifukewujin@sohu.com

10.3760/cma.j.issn.1673-4173.2016.04.018

周武军，Email:pifukewujin@sohu.com

本文主要缩写：iPS细胞：诱导多能干细胞，Oct4：八聚体结合转录因子4，BMP4：成骨蛋白4，RDEB：隐性遗传全身性营养不良性大疱性表皮松解症

2015-08-10）