中性粒细胞与炎性反应

种肖宇



·综述与讲座·

中性粒细胞与炎性反应

种肖宇

中性粒细胞(PMN)是机体非特异性防御反应的重要执行者，在炎性反应中扮演着重要角色。正常情况下，PMN 适时适度发生凋亡，并以凋亡的方式被机体及时清除，一方面可以阻止毒性细胞内容物的释放，另一方面又可减轻其坏死后释放的多种酶和毒性物质造成的组织损伤， 有利于炎症的转归。PMN凋亡延迟，致使大量蛋白酶和氧自由基释放，是造成对组织损害的主要原因。因此研究PMN凋亡与清除机制及与PMN相关的信号转导通路，有助于提高我们对PMN功能的认识。

中性粒细胞；细胞凋亡；基因调控

中性粒细胞(polymorphonuclear neutrophils,PMN)是机体固有免疫系统的重要组成部分，也是最先募集到炎症区域发挥免疫防御的效应细胞之一[1]。PMN富含胞质颗粒，这些胞质颗粒内含有大量的细胞毒性物质，这些细胞毒性物质在杀伤外来入侵的病原微生物的同时也会导致宿主细胞的炎症损伤及炎症相关性疾病。另一方面，PMN可以通过自发性凋亡的机制调控和减轻炎症损伤。因此，炎症部位PMN的水平、功能及其生命周期，影响着炎性反应的发生发展及转归。明确PMN在炎性反应中的作用，适度调控中性粒细胞凋亡，对于炎症的控制与治疗有十分重要的意义。本文对PMN在炎性反应中的作用及意义做一综述。

1 PMN的吞噬与杀菌功能

在正常情况下，PMN主要存在于外周血中，并保持静止状态。当炎症发生时，依附在血管壁的PMN被炎性因子激活，在趋化因子的作用下，通过内皮细胞迁移到细胞膜脂质双分子层，随后通过细胞外基质到达炎症部位，通过吞噬或杀菌作用清除病原微生物、细胞碎片和外源性蛋白质，并释放出一些生物活性物质(蛋白水解酶、花生四烯酸代谢产物、趋化因子、某些补体成分以及细胞因子等),吸引更多的炎性细胞到达炎症部位，增强炎性反应以加强机体清除病原微生物的能力[2,3]。PMN可以通过特异性受体(Toll-样受体和G-蛋白偶联受体)检测到细菌的组成成分如脂多糖(LPS)和fMLP，另外黏附分子和趋化因子也是调节PMN聚集的重要因子。这些因素使PMN迅速募集到炎症部位发挥吞噬杀伤作用。

PMN的杀菌因素主要有氧化性和非氧化性两类。PMN的非氧化性杀菌主要是通过脱颗粒(degranulation)释放的杀菌因子(如吞噬素、防御素等)杀灭细菌，人类PMN的杀菌因子主要分布于嗜天青颗粒的膜上。氧化性杀菌是指有分子氧参与的杀菌过程，细胞所摄取的分子氧并不直接作用于微生物，起杀菌作用的是活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)。ROS是由多亚基酶复合物-NADPH氧化酶与分子氧反应产生的超氧化物。在PMN发挥吞噬作用时，PMN的质膜结构会部分内陷，可以把细菌包裹到细胞中形成吞噬小体。在此过程中局部质膜的改变激活了质膜上无活性的NADPH氧化酶。NADPH氧化酶催化细胞摄取的分子氧，使O2进行单电子还原，生成超氧阴离子自由基O2ˉ,并进一步生成羟基自由基OHˉ、过氧化氢H2O2和单线态氧，这一过程被称为呼吸爆炸(respiratory burst)[4]。同时在吞噬过程中，PMN释放了大量的髓过氧化物酶(MPO)。H2O2在MPO的作用下和卤化物(主要是氯离子)反应，产生有效的抗菌物质次氯酸，以上反应所生成的ROS及次氯酸与细菌底物发生反应并将细菌杀死。因此，吞噬作用与产生ROS和次氯酸是机体杀伤病原体的重要机制。

2 PMN的凋亡与清除

PMN向炎症局灶的浸润是机体防御反应的重要组成部分。PMN的募集和迁移以及其释放的细胞毒性物质一方面有利于机体杀灭病原微生物，另一方面也可能加重炎性反应和周围组织损伤,甚至导致炎症迁延和慢性化[5]。如果细胞凋亡或吞噬机制发生障碍,PMN在炎症灶内被延迟清除或继发坏死，势必会导致炎症的持续和组织损伤增加，甚至会引起难治性疾病。凋亡是炎症部位细胞的非炎症性死亡形式，全面了解PMN凋亡及清除对控制和治疗炎症相关疾病有至关重要的作用。

2.1 PMN自发性凋亡 细胞的凋亡，指为达到内环境的稳定，细胞在基因的控制下有序的死亡。在发生机制上，PMN同其他的血细胞稍有不同，中性粒细胞在成熟后的24 h内，就启动它的自发性凋亡程序(spontaneous apoptosis program)，将在短时间内死亡。存在于血液中的中性粒细胞的半衰期仅为6～8 h，肝脏和脾脏中的巨噬细胞可以识别并及时清除血液循环中已经凋亡的PMN，附近组织中固有的吞噬细胞可以将游走于组织中的凋亡的PMN清除[6]，这一过程都不会引起炎性反应。

2.2 凋亡PMN的清除 机体某一部位如果发生炎症，存在于这一部位中的PMN将不会再回到血循环中，只能被清除。炎性反应能否消退的必要条件之一就是炎症部位PMN的快速清除。从机体内清除PMN必须要有巨噬细胞的介导，已知一些巨噬细胞受体参与了这个过程。这些分子包括磷脂酰丝氨酸(PS)受体，补体受体，清道夫受体和凝集素，CD14和CD44。

3 PMN凋亡的影响因素

PMN的凋亡是在高度精密调节下有序的走向死亡过程，由内在和外在机制共同介导，受自身多基因调控和众多细胞因子及其他多种因素共同作用的一个复杂的过程。

3.1 PMN 凋亡的自身基因调控 Bcl-2基因家族被认为是参与调控细胞凋亡的重要基因。Bcl-2基因家族既有促进细胞凋亡的基因(Bax、Bak、Bad)，也有抑制细胞凋亡的基因(Bcl-2、Bcl-XL、Mcl-1、A-1 等)，这两组作用相反的基因相互作用共同对细胞的凋亡进行调控。Mcl-1位于PMN的细胞核和细胞质，在衰老凋亡的PMN中，Mcl-1表达水平迅速下降，同时伴有Mcl-1 mRNA的减少，这表明PMN的凋亡与Mcl-1表达有关。从末梢血分离中性粒细胞并进行体外培养实验可以检测到Bcl-XL 和Mcl-1 基因从高表达到表达逐渐低下直至消失,这表明Bcl-XL 和Mcl-1 基因与PMN自发性凋亡的进程有直接关联。A-1 基因稳定的表达于人类的中性粒细胞。早幼粒细胞HL-60经过全反式维甲酸诱导分化成中性粒细胞后，A-1 mRNA表达增强，提示A-1对于PMN凋亡的调控具有重要作用。线粒体凋亡途径是细胞凋亡的信号转导途径之一，Bax通过与线粒体的相互作用影响PMN的凋亡[7]。抑制Bax的体内裂解会导致炎性反应加重，表明Bax是缓解急性炎症重要物质[8]。由上所述，PMN的自发性凋亡同Bcl- 2 基因家族有极大的关系。

3.2 PMN 凋亡的分子基础与信号转导途径

3.2.1 PMN凋亡的caspase 级联反应:Caspase家族是细胞凋亡的重要参与者。Caspase即半胱天冬酶,是白细胞介素-1β转化酶(ICE) 家族的总称。PMN可以表达多种caspase,包括caspase- 1、caspase- 3、caspase- 4、caspase-8和caspase- 9等。caspase-3的活化是中性粒细胞自发性凋亡的重要环节。Caspase-3、caspase-8 和caspase-9触发蛋白水解级联反应，活化核酸内切酶，使DNA片段化，导致中性粒细胞的凋亡[9]。Taneja等[10]最近一项研究发现败血症患者体内caspase-3和caspase-9的活性显著降低，从而延长了中性粒细胞的生命期限，说明了Caspase家族在炎性反应中的重要作用。

3.2.2 PMN凋亡的信号转导途径:PMN凋亡信号转导途径主要包括死亡受体途径、p38MAPK通路等促进PMN凋亡途径和NF-κB 通路、PI3K- Akt通路、ERK通路等抑制PMN 凋亡途径。

死亡受体是肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族中的一员，包括Fas和TNFR等。死亡受体与死亡配体(FasL、TNFα)结合后形成死亡信号诱导复合物，活化caspase家族，最终导致细胞凋亡。Fas/FasL通路是多种细胞凋亡的基本信号转导途径。人类PMN的表面既表达Fas(CD95)，也表达可溶性Fas配体(FasL，CD95L)。Fas介导的PMN的细胞凋亡可以被 GM-CSF、G-CSF、IFN-γ、TNF-α等抑制，从而显示出PMN凋亡信号传导途径调节的复杂性。PMN表达两种TNFR，TNFR1(55-R，CD120a)和TNFR2(75-R，CD120b)，这两种受体在PMN凋亡过程中的作用稍有不同。TNF-α介导的PMN的凋亡需要 TNFR1参与，TNFR2可以增强TNFR1促进细胞凋亡的能力。用特异性抗体阻断TNFR1但不阻断TNFR2，可观察到PMN凋亡受到了抑制。与Fas/FasL介导的细胞凋亡不同的是TNFR介导细胞凋亡并不仅仅依靠对caspase的激活[11]。TNFR1 除了介导PMN 凋亡，还可以激活NF-κB，抑制凋亡的发生。这可以部分解释TNF-α对PMN凋亡具有双向调节的作用。另外，TNF-α诱导PMN凋亡的能力与ROS的产生有关，因为慢性肉芽肿(CGD)患者体内的PMN在高浓度的TNF-α条件下也无法凋亡。患有TNFR相关周期性综合征(TRAPS)的个体存在TNFR缺陷，因此患者体内TNF-α介导的PMN会逐渐凋亡直至减少[12]。

丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)属于细胞外信号调节蛋白激酶，MAPK的激活参与细胞凋亡的内在过程。已知MAPK有三种，包括 p38MAPK和细胞外信号调节激酶(ERK)，以及活化蛋白激酶/氨基端激酶(SAPK/JNKc-Jun)。ERK 和p38MAPK 参与调控PMN凋亡，p38MAPK 的激活可促进细胞凋亡，ERK的激活后则抑制细胞凋亡。ERK 和p38MAPK 这两种调节途径是相互促进相互制约的关系。

NF-κB参与炎性介质导致的PMN 凋亡延迟。LPS、TNF等多种因素能激活NF-κB 从而抑制PMN凋亡[13]。NF-κB活化后可促进促炎因子(IL-6、IL-8)和趋化素(MIP-2)的表达，从而达到诱导PMN 趋化因子和黏附分子的分泌与释放的目的，进而可以抑制PMN的凋亡过程。NF-κB诱导细胞可以表达TNFR1结合因子及凋亡抑制蛋白，阻断由死亡受体TNFRI及Fas 介导的凋亡信号的传导，抑制细胞凋亡的进程。同时NF-κB 也可以直接阻断Caspase-8，并且可以由此来抑制一系列Caspase 的活化，这也是其抗凋亡的重要机制[14,15]。A-1 基因上存在NF-κB结合序列，NF-κB活化可通过调控A-1基因的表达来抑制PMN 凋亡。由上可见， NF-κB是PMN 凋亡的重要转录因子。

磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)和蛋白激酶B(Akt)信号通路是细胞内的重要信号转导通路，其作用机制是通过活化信号通路下游的多种效应分子来调节细胞的增殖、分化与凋亡。Akt是PI3K 信号通路中最主要的靶酶。激活Akt可以使Bad、caspase-9、caspase-3、糖原合酶激酶-3等下游底物达到磷酸化从而调控细胞凋亡。PI3K-Akt能直接或间接影响转录因子(NF-κB、p53 等)来调控细胞凋亡[16]。另外，PI3K-Akt途径参与了GM-CSF依赖的PMN凋亡抑制。

3.3 PMN凋亡的其他影响因素 许多炎症相关的因子可以影响中性粒细胞自发性的凋亡进程。细胞因子如IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、GM-CSF、G-CSF 等可抑制PMN的自发性凋亡，其中GM-CSF的抑制作用最强。GM-CSF和G-CSF可以使PMN保持其趋化和吞噬能力，表明抑制细胞凋亡与PMN功能的保护相关[17]。另一些因子如TNF-α和IL-10等可加速PMN凋亡。PMN吞噬细菌后产生大量的细胞因子和趋化因子参与炎性反应，这些因子的产生与基因表达水平有关。

PMN 的凋亡与细胞保持氧化剂-抗氧化剂平衡能力相关 ，ROS和氧化应激可以通过破坏线粒体膜导致PMN的凋亡。如果细胞内H2O2减少，则PMN的凋亡进程将会受到明显的抑制，氧化反应过程中产生的ROS可能是PMN 凋亡的重要原因。氧化剂能够降低细胞内的抗氧化防卫系统的功能，介导PMN凋亡的启动过程。

4 PMN自发性凋亡的调控对于炎性反应的意义

PMN对微生物最初的吞噬作用可以上调PMN编码蛋白的转录，在急性炎性反应中起重要作用，是抵御微生物入侵的关键。然而，一旦PMN吞噬微生物后，开始逐渐丧失其生物学功能并诱导细胞的凋亡[18,19]。一般情况下，初级PMN的功能包括趋化、吞噬作用、生成超氧物质和脱颗粒，这些功能随着细胞凋亡而逐渐丧失[20]。

凋亡的PMN不仅会丧失其生物学功能，还更加容易被吞噬细胞识别并吞噬。同时吞噬细胞在吞噬大量凋亡PMN后，其自身的产生和释放促炎介质的功能将会受到抑制。所以，炎症部位中的PMN凋亡和清除之间保持着动态平衡，这样既减少了炎症部位由于PMN的过度激活和聚集而加重炎性反应，同时又可以避免凋亡的PMN发生继发性坏死并释放毒性内容物引起的组织损伤。由此可知，PMN的自发性凋亡是介导炎性反应终止的重要生物步骤，是炎症无损伤收敛的重要机制之一[21]。

作为非炎性清除PMN的主要方式，凋亡启动的时机和程度决定了炎性反应的发展和转归。因此，人为地调控PMN 凋亡有利于监测与调节机体的炎性反应。随着对PMN自发性凋亡研究的不断深入，我们可以通过诱导机制来加速PMN的凋亡或通过给予特异性药物来达到增强吞噬细胞清除凋亡PMN的能力，为炎症的治疗提供更为合理的方案。

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