热休克蛋白70-2在精子发生及精卵识别中的研究进展*

雷　辉，　饶　猛，　朱长虹

华中科技大学同济医学院计划生育研究所，武汉　430030



综述

热休克蛋白70-2在精子发生及精卵识别中的研究进展*

雷辉，饶猛，朱长虹△

华中科技大学同济医学院计划生育研究所，武汉430030

精子发生；热休克蛋白70-2；减数分裂；精卵识别

热休克蛋白(heat shock protein，HSP)是所有生物细胞在理化和生物等应激原刺激后，发生热休克反应时所产生的一类伴随细胞内功能性蛋白的伴侣蛋白分子。热休克蛋白根据分子量大小，主要分为4个家族：HSP90家族(83～90 kD)、HSP70家族(66～78 kD)、HSP60家族及小分子HSP家族(15～30 kD)。此外还有分子量在100～110 kD的大分子HSPs。HSP70家族是HSP中最大的家族，也是研究最深入的一种，在人类基因组至少包含13种成员，其中只有小部分是热休克反应时所产生的[1]。精子发生是一个高度复杂的细胞分裂分化过程，历经精原细胞的增殖分化、精母细胞的减数分裂以及精子变形3个阶段。HSP70-2(HSPA2)是HSP70家族中的一员，目前各类研究表明它是人类以及啮齿类动物睾丸中的生精特异性蛋白，在精子发生、调控以及精卵识别中具有重要作用，与男性生殖功能密切相关。迄今为止，关于HSPA2在精子发生中作用的研究较为零散，本文将对其进行总结，从HSPA2基因的发现、在热应激及缺氧状态下的表达、在精子发生和精卵识别中的作用等方面进行综述。

1　HSPA2基因的发现

Krawczyk等[2]对从大鼠睾丸中分离出的总RNA进行检测，发现了一个含量相当丰富的2.5 kb转录产物，这是第1次检测出睾丸特异性HSP-70相关基因的存在。随后Zakeri等[3]则使用PM1.8质粒作为探针筛选小鼠DNA基因库鉴定出小鼠HSPA2基因，其研究显示大鼠和小鼠HSPA2基因的转录单位结构相似，它们都在5′端未翻译区有一个内含子，除此之外，大鼠和小鼠的两个主要转录起始点(T2和T1)分别位于ATG起始密码子上游115碱基对和350碱基对附近。尽管它们的转录产物大小相似，但是5′尾端的结构不同，来源于较远处T1起始位点的转录产物经历了剪接过程，而来源于T2处的则没有[4-5]。这个基因最终从大鼠基因组中分离、克隆，命名为HSPA2[6]。

人类HSPA2基因是从人胎盘基因库中克隆而得到，5′RACE和RT-PCR分析显示它不含内含子，且仅有一个转录起始位点，只表达一种mRNA。人HSPA2基因编码的蛋白质与基因家族的其他成员的氨基酸序列相似性较低，例如与HSC70和HSP70-1的相似性分别为86.1%、83.3%。但是与小鼠和大鼠HSPA2基因所编码的产物的氨基酸序列相似性却达到98.2%、98.4%。除此之外，人类HSPA2蛋白质靠近羧基末端处插入的7个氨基酸是人类和鼠类HSPA2蛋白质最显著的不同。尽管人HSPA2基因在大部分组织中都有表达，但是在睾丸和肌肉组织中表达量最高，目前对其在睾丸中的表达研究也最为深入[7-8]。

2　HSPA2基因在热应激和缺氧状态下的表达

当体细胞暴露于热应激时，热激转录因子1(HSF1)与应激诱导基因激活子中的热应激应答元件(HSES)相结合激活HSP基因的一个子集，激活的HSP基因表达相应的热休克蛋白随后参与热休克反应。虽然鼠类HSPA2基因也包含HSE类似序列，但是它和典型的HSE相比具有很低的相似度，也并不能和HSF1结合形成活性突变体。Krawczyk等[9-10]建立一个大鼠隐睾模型来增加睾丸周围温度，结果发现HSPA2 mRNA的快速消失以及生精上皮细胞的变性；除此之外，在睾丸持续性表达HSF1的转基因小鼠模型中，检测睾丸中HSPA2基因的表达产物，和正常小鼠对比发现HSF1的持续表达也并没有激活HSPA2基因，反而导致生精细胞的凋亡增加[11]。截止目前，HSF1影响HSPA2基因表达的机制依旧不清楚，研究推测有些基因能够编码对HSPA2表达有重要作用的因子，而HSF1则可能抑制这些基因的表达来影响睾丸中HSPA2的表达[10]。

在后续研究中证实了应激也不能诱导人类HSPA2基因的表达，而且在人类细胞中也并不能检测到HSF1与HSP激活子之间的结合；尽管热激并不能诱导体细胞中HSPA2基因的表达，但是温度突然上升会导致HSPA2蛋白快速从细胞质转移到胞核、核仁以及中心体区域；这表明在热应激环境下，HSPA2可能参与保护细胞核或是中心体完整性的过程[12-15]。

缺氧诱导转录因子1(HIF1)是在细胞缺氧状态下表达明显上调的因子，功能激活研究以及染色质免疫沉淀分析证实HIF1与HRE(缺氧应答元件)的相互作用能够调节HSPA2基因的激活。已有研究显示缺氧增加了人类肝脏、乳腺以及宫颈肿瘤细胞中HSPA2的表达[16]。

3　HSPA2在精子发生中的作用

3.1在减数分裂过程中的作用

HSPA2在啮齿类及哺乳类动物精子发生过程中发挥重要的作用，主要表现在对减数分裂过程的调节。减数分裂是一个极其复杂的过程，需要许多新的结构蛋白和酶的参与，它们对染色体的排列、断裂、重组和修复等具有重要意义。减数分裂始于细线前期的初级精母细胞，经历偶线期、粗线期、双线期、次级精母细胞后，形成圆形精细胞。

研究发现在野生型小鼠粗线期精母细胞内，HSPA2沿着联会复合物形成的结构分布，并参与联会复合物消失的过程[17-18]。HSPA2基因敲除时则可观察到精子发生过程停滞于G2/M期，而且并不会进展到M期的减数分裂阶段。周期蛋白CDK1/Cyclin B1异时相的表达有助于正常细胞进入细胞分裂周期，而HSPA2在初级精母细胞CDK1/Cyclin B1复合物的形成中是必不可少的，但是HSPA2仅与CDK1相互作用，因此若CDK1与Cyclin B1形成复合物则不再与HSPA2相互作用[19]。Alekseev等[20]发现这种复合物的活性至少接受2种蛋白的调节：睾丸特异性可变连接组蛋白H1(H1t)、睾丸/胚胎形式的核自身抗原精子蛋白(tNASP)，而tNASP属于特异性组蛋白分子伴侣家族，它能促进染色质中连接组蛋白的结合和细胞周期的G1/S期的发展[21]。数据显示在小鼠的初级精母细胞中，tNASP、H1t、HSPA2以及CDK1之间会发生相互作用。H1t与tNASP-HSPA2复合物相结合，增强HSPA2内在ATP酶活性以及与CDK1的结合能力，与此同时，阻止Cyclin B1与HSPA2/CDK1复合物的结合。总而言之，tNASP和H1t之间的协调合作调控了HSPA2的能力，有助于形成有活力的CDK1/Cyclin B1复合物，并进一步调控了减数分裂的发展历程[20]。

大量的生物化学及临床观察结果表明人类男性生育力同样需要HSPA2基因的表达，它在精子发生、成熟过程和精子受精能力中扮演着重要的角色。但是到目前为止，各类发表的研究结果显示人类和啮齿类精子发生过程中HSPA2的功能和表达模式可能没有完全重叠。在人类睾丸中，HSPA2在长形精子及精细胞中的表达要明显高于初级精母细胞[22-24]。除此之外，既没有文献表明人类HSPA2在联会复合体分离中的作用，也没有文献表明它在CDK1/Cyclin B1复合物成分中充当分子伴侣。

3.2在精子变形中的作用

在精子发生过程中，最明显的形态学变化是精子细胞的改变，其中细胞核的浓缩对精子形成至关重要。核浓缩时，生精细胞核内核蛋白组分发生了明显的变化，先由富含赖氨酸的体细胞型组蛋白被睾丸特异性的组蛋白取代，最后被富含精氨酸和胱氨酸的精核蛋白所取代。精核蛋白能中和DNA电荷，降低DNA分子间的静电排斥作用，并通过二硫键的交联形成致密的细胞核。

实验数据表明，在小鼠精子发生过程中，HSPA2同样参与了染色质的压缩过程。染色质压缩的起始阶段，核心组蛋白和连接组蛋白被它们的睾丸特异性类型所取代，与此同时，染色质的高度乙酰化破坏了核小体结构，并有助于TPs(转化蛋白)和DNA折叠蛋白质取代睾丸特异性组蛋白[25]。Govin等[26]采用蛋白组学分析以及显微镜观察揭示了长形精细胞中的HSPA2经历了从核内到顶体下结构域的重新分布，并表明这种行为与组蛋白乙酰化的终止和组蛋白的迁移有关联。随后对包含TP1、TP2、HSPA2的复合物进行检测，结果显示HSPA2在TPs参与DNA折叠过程中扮演了一个特殊的分子伴侣，参与新的精细胞特异性核结构的组装。

染色质的压缩过程中，TPs依赖HSPA2对组蛋白进行替换的过程受到PARP-1和PARP-2两种多聚聚合酶的调控。这2种酶属于多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)大家族，在精子发生过程中，这个家族的成员有助于染色质重组等各种生理过程的表观遗传调控[27-29]。大量质谱分析表明在小鼠的精细胞中，PARP-2依赖TP2与HSPA2发生相互作用，而PARP-1则通过ADP核糖基化修饰HSPA2结构。以上研究结果表明，HSPA2能与TP2、PARP-2、PARP-1一起形成精子特异性复合物，可能在染色质重塑中扮演着至关重要的角色。除此之外，HSPA2依赖PARP-1和TP依赖PARP-2进行的多聚ADP核糖基化过程、以及HSPA2对TP2及TP1的伴侣行为都可能有助于染色质重组和精子的形成[28]。

HSPA2除了通过与TP、PARP相互作用来参与染色质重组过程以外，还有些间接证据表明HSPA2的磷酸化也能影响精子特异性染色质重组过程。根据PhosphoSitePlus数据库，HSPA2丝氨酸和苏氨酸残端在体内能被磷酸化，而且在丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶1γ2(PPP1CC2)潜在作用对象中也可找到HSPA2[30]。PPP1CC2是PPP1CC基因编码的2种剪接亚型中的一种，它的表达受到生精细胞的限制。Forgione等[31]的研究显示PPP1CC基因受损时将导致异常的精子发生，例如组蛋白滞留产生的异常染色质、生殖细胞凋亡数量增加、长形精细胞数量减少等。由于PPP1CC2能直接与HSPA2发生作用，而且它的损耗能引起睾丸中HSPA2的高磷酸化累积，故可以推测HSPA2这种依赖PPP1CC2对自己的结构和活性进行调节的行为将有助于小鼠生精过程中的染色质重塑[30]。

4　HSPA2在精卵识别中的作用

精子膜表面与卵子透明带表面都有特殊的相互识别装置，识别是受精过程的启动或扳机，也是保证种族特异性的关键。尽管对HSPA2在获能精细胞内的定位存在争议，但是不可否认HSPA2在精卵识别上有着重要作用[23-24，32]。

当HSPA2在精细胞中表达水平下降时，精子与卵子的相互作用能力以及精子受精能力也会随之下降，这也往往预示着体外受精的失败[33-34]。根据Redgrove等[32]的研究结果可知HSPA2是多聚体精卵识别复合物中的一员，这个复合物还包含精子黏附分子1(SPAM1)和芳基硫酸酯酶(ARSA)2种蛋白成分，这2种蛋白在以前就证实参与了精卵间的相互作用，在其研究模型中，HSPA2定位于细胞内，它的活性能为SPAM1和ARSA的运动提供动力。对HSPA2/ARSA/SPAM1复合物的动态结构进行观察，可知HSPA2的磷酸化是通过蛋白激酶A的活性来调节的。这进一步说明HSPA2翻译后的修饰对它的活性有至关重要的影响。尽管HSPA2在精卵识别中扮演着重要的作用，但是对于HSPA2是否能在后续的顶体反应以及精卵融合中继续发挥作用，我们仍然需要进一步探索才能了解它在受精过程中更为全面的功能。

5　结语

HSPA2蛋白已经研究了30余年，除了睾丸，人体某些特定的体细胞也能表达HSPA2，甚至在某些肿瘤细胞中还能检测到它的表达，但是在其它细胞中的研究并不深入，并未发现HSPA2的特异性功能[35]；HSPA2作为在睾丸中发现的特异性蛋白，它在精子发生过程中所发挥的作用一直是研究热点。大量文献已表明它在精子的减数分裂、精子的成熟变形以及精卵识别过程中扮演着重要角色。尽管迄今为止对HSPA2在精子发生中的功能研究得越来越深入，相互关联的作用机制也逐渐被发现，但在精原细胞的增殖分化过程中并未检测到HSPA2的功能表达，而且人类生殖细胞中HSPA2的具体作用机制仍不够明朗。因此，仍需要后续的大量实验进一步证实这其中的诸多猜测，并对此展开深入研究，为探索男性不育的分子靶点提供新的思路。

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(2015-09-17收稿)

，Corresponding author，E-mail：reprodcentre@163.com

R34

10.3870/j.issn.1672-0741.2016.04.026

*十二五科技支撑计划资助项目(No.2012BAI31B08)；国家自然科学基金资助项目(No.31171380)

雷辉，女，1990年生，医学硕士，E-mail：1012782592@qq.com