结核分枝杆菌耐药分析与基因检测分析

黄裕春

[摘要] 目的 探讨结核分枝杆菌耐药情况及基因检测分析。 方法 从2012年3月～2014年3月我院收治的结核病患者中选取62例为研究对象，按随机数字法对患者进行分组，首次诊治患者39例为观察组，首次诊治失败后行第二次治疗患者23例为对照组，对所有患者结核分枝杆菌进行耐药分析及rpsL、rpoB、embB、KatG基因检测。 结果 62例患者中共19例出现耐药，耐药率为30.65%，对照组患者1种药物耐药率为26.09%，同观察组10.26%比较，差异有统计学意义（P<0.05），2种药物耐药率为17.39%，同观察组7.69%比较，差异有统计学意义（P<0.05），3种药物耐药率为8.70%，同观察组比较，差异有统计学意义（P<0.05）；rpsL、rpoB、embB、KatG基因突变率分别为83.33%，86.11%，88.89%，91.67%，x2检验显示，差异无统计学意义（P>0.05）。 结论 结核分枝杆菌耐药的产生同菌株基因具有较大关联，且耐药率同治疗次数有关，在结核病临床治疗中，需根据患者耐药情况，选择联合用药方案，提高治疗效果。

[关键词] 结核分歧杆菌；耐药；基因；检测

[中图分类号] R378.911 [文献标识码] B [文章编号] 2095-0616（2015）24-213-03

[Abstract] Objective To investigate the analysis in drug resistance of bacteriology tuberculosis and genetic testing. Methods 62 cases of TB patients from March 2012 to March 2014 in our hospital were selected as the objects，and allocated into an observation group and a control group according to the randomly grouping method，first diagnosis and treatment in 39 patients in the observation group，first diagnosis and treatment failure underwent secondary treatment of 23 patients in the control group，all patients were resistant Bacteriology tuberculosis was analyzed and rpsL，rpoB，embB，KatG genetic were tested. Results 62 cases of patients with 19 cases of drug resistance，the drug resistance rate was 1，the control group of patients with 26.09% was compared with the control group（10.26%）， （P<0.05），2 drug resistance rate was 17.39% and 7.69%，the differences were significant （P<0.05），3 drug resistance rate was 8.70%， compared with the observation group， the difference was statistically significant （P<0.05）；rpoB，embB，rpsL，KatG gene mutation rate was 86.11%，88.89%，91.67%，83.33%，x2 test showed no statistical significance （P>0.05）. Conclusion The generation of drug-resistant Bacteriology tuberculosis strains with genes associated with a larger，and the number of drug-related rates with treatment in the clinical treatment of tuberculosis，to be based drug resistance in patients choose combination therapy programs， improve the therapeutic effect.

[Key words] Bacteriology tuberculosis；Drug resistance；Gene；Detect

重大传染性疾病对于人们健康及社会稳定均具有较大危害，因此，对其进行快速诊断历来为人类生存发展所必须。自1882年发现结核分枝杆菌以来，结核病便成为严重影响患者健康的重要传染疾病。世界卫生组织1993年称“全球结核病处于紧急状态”，1998年称“遏制结核病行动刻不容缓，1999年数据显示[1]，全世界每年因结核病死亡人数高达300万，是其他传染病死亡人数之和；世界卫生组织（WHO）将结核病与艾滋病、疟疾列为21世纪人类需要攻克的三大传染性疾病之一。资料显示[2]，我国结核病感染者达5.5亿，发病率、死亡率和耐药率均明显高于发达国家水平。而耐药结核的出现，给结核病的防控与治疗增加了难度，本研究对62例结合并患者的耐药情况进行分析，结合基因检测方法，对结核分析杆菌耐药原因进行分析，为结核病的防治提供更为科学的参考依据。

1 资料与方法endprint

1.1 一般资料

从2012年3月～2014年3月我院收治的结核病患者中选取62例为研究对象，男36例，女26例，年龄18～71岁，平均（45.3±3.2）岁，按随机数字法对患者进行分组，首次诊治患者39例为观察组，首次诊治失败后行第二次治疗患者23例为对照组，全部患者均留取痰标本，经Bactec-960增菌培养与7H9培养基培养，抽取其临床分离株为研究材料，并行耐药检测。两组患者在性别、年龄方面比较差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性，见表1。

1.2 方法

1.2.1 仪器与试剂 主要仪器包括：微生物培养箱；生物安全柜；罗氏培养基。药物包括：链霉素（SM）、异烟肼（ING）、乙胺丁醇（EMB）及利福平（RFP）。罗氏培养基作为药敏试验方法。

1.2.2 检测方法 采用PCR-反向斑点杂交技术对结核分枝杆菌中的rpoB、KatG基因及rpsL基因突变进行检测，并根据结核分枝杆菌野生株序列，设计覆盖rpoB、KatG基因和rpsL基因核心突变区的系列寡核苷酸探针并将其固定在尼龙膜上，并应用生物素标记的特异性引物扩增包含核心突变区的基因片段，与固定在膜上的寡核苷酸探针杂交，对突变位点进行快速检测。从62株临床分离株中挑选36株耐药株进行药敏实验。

抗性相关基因的测序方法：通过PCR-DS（聚合酶链反应-直接测序法）对临床分离的结核分歧杆菌的抗药相关rpsL、rpoB、embB、KatG基因基因进行快速检测。同时，根据野生株序列，设计覆盖rpsL、rpoB、embB、KatG基因核心突变区的引物，在经PCR扩增后，采用测序仪进行测序，同时与标准序列进行对比，对突变进行分析。

1.3 统计学方法

将数据纳入SPSS17.0软件中分析，计数资料采用x2检验，并以率（%）表示，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 耐药分析

62例患者中共19例出现耐药，耐药率为30.65%，对照组患者1种药物耐药率为26.09%，同观察组10.26%比较，差异有统计学意义（P<0.05），2种药物耐药率为17.39%，同观察组7.69%比较，差异有统计学意义（P<0.05），3种药物耐药率为8.70%，同观察组比较，差异有统计学意义（P<0.05），提示治疗次数可增加结核分枝杆菌的耐药性，见表2。

2.2 基因检测

62例患者中rpsL、rpoB、embB、KatG基因突变率分别为83.33%，86.11%，88.89%，91.67%，x2检验显示，经不同的抗结核药物治疗后，rpsL、rpoB、embB、KatG基因突变率，差异无统计学（x2=1.0610，P>0.05），见表3。

3 讨论

重大传染性疾病对于人们的健康及生活质量具有重大影响，其中，结核病具有极高的发生率及危险性，同艾滋病及疟疾并列为人类最难攻克的3大传染性疾病[3]。有报道显示[4]，在我国结核病发生率、患者死亡率及病菌耐药率同发达国家水平相比，均明显较高，每年近13万结核病患者死亡。另有研究指出[5]，近年来由于抗生素的不合理应用及耐药结核的出现，使得我国结核病总耐药率明显上升。因此，对于耐药及耐多要结核病的防治，成为临床研究热点。链霉素（SM）、异烟肼（ING）、乙胺丁醇（EMB）及利福平（RFP）是治疗结合并的一线抗结核药物，因此，目前对于上述药物的耐药性分析，一直是研究重点[6]。结核分歧杆菌耐耐链霉素的产生，同其核糖体蛋白S12的编码基因rpsL的缺失有关；耐异烟肼的产生，同过氧化氢酶-过氧化物酶的编码基因KatG基因的缺失有明显关联；而EMB基因突变是耐乙胺丁醇的原因；耐利福平是因核心区域rpoB基因突变所致[7]。

有学者指出[8-9]，对于结核病致病体的检测与耐药性分析，对于疾病的防治具有重要意义。关于治疗次数与耐药性的关系，学界普遍认为两者呈正相关性，临床观察发现，结核病复发后第二次进行治疗的患者耐药率同首次资料患者相比，明显较高，因此，在临床治疗中，需对耐药率进行分析，有效指导临床用药。本研究中首次诊治失败后行第二次治疗的对照组患者耐药率同对首次治疗的观察组比较明显较高，差异有统计学意义（P<0.05），且总耐药比例略高于国结核病总耐药率，表明患者治疗次数对于耐药率有较大影响。以往研究在进行耐药分析时，未注重患者诊治次数，因此对于耐药性的分析缺乏客观性及准确性，本研究对不同治疗次数患者的耐药率进行对比分析，发现首次诊治失败后行第二次治疗患者耐药率较高，可能同抗结核药物的剂量较大，时结核分歧杆菌耐药性增强有关，因此，在结核病治疗中，需尽量采用科学方法，缩短疗程，预防复发，减少病菌耐药性。同时，本研究结果还发现，多种药物联用，患者耐药率较低，表明在结核病治疗中，采用联合用药方法，可有效提高治疗效果。

在以往较长时间，比例法及绝对浓度法是结核分枝杆菌耐药性的常用测定方法，但有学者认为[10-11]，采用上述方法，耐药性测定时间达到6～8周，甚至需要更长时间，不能对临床治疗进行及时指导。近年来由于分子生物技术取得了明显进步，分枝杆菌耐异烟肼、耐利福平、耐链霉素及耐乙胺丁醇的相关基因被发现。有学者[12]通过PCR技术对临床分离株rpsL、rpoB、embB、KatG基因突变进行检测，结果发现耐药株rpsL、rpoB、embB、KatG基因突变率较高，接近90%，本研究中上述耐药株的基因突变率分别为83.33%、86.11%、88.89%与91.67%，结果同相关文献报道一致[13]。表明采用PCR技术对耐药基因进行检测，具有较高的灵敏性与特异性。

尽管PCR技术在耐药基因检测中具有较高价值，但临床观察发现，PCR技术实践中也存在一些问题，如需要对病原体进行培养和专门的PCR仪进行检测，且操作较为繁琐，易出现交叉污染。有研究表明[14]，采用恒温核酸扩增法（LAMP）技术进行基因检测，不仅具有同PCR技术一致的高特异性与灵敏性，且不需要特殊试剂，不需要预先进行双链DNA的变性，同时，该技术还具有快速、高效扩增的优势。有学者[15-16]应用环介导等温扩增（LAMP）和原位荧光环介导等温扩增技术，在疾病靶基因六个区域的特异引物进行等温扩增，最后通过颜色变化判读结果，避免了 PCR 对仪器的依赖；仅需要水浴锅即可，大大降低了使用成本；检测快速、简便、准确、不依赖仪器设备，特别适用于基层社区和农村广大人民群众的健康需求，具有重大的经济效益。endprint

综上所述，对结合分歧杆菌耐药性进行分析，对于结核病临床治疗与疾病的预防控制具有重要指导作用，PCR及LAMP技术对耐药基因进行检测均具有较好效果。

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（收稿日期：2015-09-09）endprint