急性冠脉综合征患者血小板反应蛋白-1基因多态性分析

高磊，何国平，钱亿超，戚传平

· 论著 ·

急性冠脉综合征患者血小板反应蛋白-1基因多态性分析

高磊1，何国平1，钱亿超1，戚传平2

目的研究中国人群血小板反应蛋白-1（TSP-1）基因A2210G（N700S）多态性与急性冠脉综合征（ACS）的相关性。方法采用病例-对照研究，入选2005年6月～2010年11月在江苏大学附属武进医院和江苏省人民医院住院的412例ACS患者及同期337例非冠状动脉粥样硬化性心脏病（冠心病）者作为对照组，应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析的方法检测TSP-1 A2210G多态性，采用logistics回归分析TSP-1基因多态性分布与ACS的相关性。结果TSP-1基因A2210G多态性AG基因型在ACS组和对照组的分布无显著性差异（1.5% vs. 0.6%，P=0.43），未检测到GG纯合子。G等位基因频率在ACS组和对照组分别为0.7%、0.3%（P=0.43）。多元Logistic回归分析显示，TSP-1基因AG基因型与ACS无显著相关性（OR=2.36；95%CI：0.46～12.48；P=0.46）。结论TSP-1基因700N→S变异在中国人群中发生频率低，且与ACS的发病无显著相关性。

血小板反应蛋白；基因多态性；急性冠脉综合征

急性冠脉综合征（acute coronary syndrome，ACS）是冠状动脉粥样硬化性心脏病（冠心病）的一种严重类型，是一组由急性心肌缺血引起的临床综合征，包括急性ST段抬高型心肌梗死、急性非ST段抬高型心肌梗死及不稳定型心绞痛。ACS最主要的发病机制是不稳定斑块破裂或糜烂和继发血栓形成。在被AHA评为当年十大研究进展之一的GeneQuest研究中，Topol等[1]发现血小板反应蛋白-1（thrombospondin-1，TSP-1）基因多态性A2210G（N700S）在冠状动脉粥样硬化不稳定斑块形成过程中起着重要的作用，与急性心肌梗死的危险性显著相关。本研究旨在探讨TSP-1 N700S多态性与中国人群ACS的可能关系。

1 资料与方法

1.1 研究对象入选病例来源于2005年6月～2010年11月在江苏大学附属武进医院和江苏省人民医院的心内科住院患者。其中ACS组412例，疾病诊断标准为2002年AHA/ACC关于ACS的诊断指南，其中男性298例，女性114例，平均年龄（65.24± 10.95）岁。对照组337例，其中男性232例，女性105例，平均年龄（63.66±11.76）岁，经检查排除冠心病。所有病例均为中国人群，并排除恶性肿瘤、心肌病、先心病及严重肝病和肾病等。

1.2 研究方法采集外周静脉血约2 ml，分离出白细胞，以酚-氯仿法提取基因组DNA。PCR扩增体系总体积为50 μl，包括10×缓冲液5 μl、上下游引物各20 pmol、4种dNTP终浓度为0.2 mmol/ L、Mg2+终浓度为2.0 mmol/L、DNA模板100 ng和Taq DNA酶1.25 U。上游引物为5′-AAGAACGC CAAGTGCAACTAC-3′，下游引物为5′-AGAGCTAGCCCTGTTCATGTT-3′。PCR反应条件：先95℃预变性5 min，然后按95℃ 40 s、59℃ 30 s、72℃ 40 s进行33个循环，最后72℃延伸5 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，UVI自动凝胶成像分析系统观察扩增结果。PCR产物用限制性内切酶BsrⅠ于65℃消化约12 h，酶切产物经2%琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像系统观察结果。进一步抽取部分PCR扩增产物进行测序鉴定。

1.3 统计学分析用SPSS 10.0软件进行统计学分析。计量资料用均数±标准差（s）表示，使用t检验比较。计数资料用例数（构成比）表示，使用χ2检验比较。关联程度用优势比（OR）和95%可信区间（CI）表示，使用logistic回归分析计算。以P＜0.05为统计学差异有显著性。

2 结果

2.1 两组一般临床资料比较ACS组和对照组在年龄、性别、舒张压（DBP）、总胆固醇（TC）及低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）等方面比较，差异无显著性意义（P＞0.05）。ACS组吸烟率、高血压和糖尿病比例、空腹血糖（FPG）、收缩压（SBP）及三酰甘油（TG）水平明显高于对照组，而低密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）水平明显低于对照组（P＜0.05）（表1）。

表1 两组患者一般临床资料比较

2.2 TSP-1基因型分析PCR扩增产物为360 bp的片段，如果存在等位基因G，当用内切酶BsrⅠ酶切后可产生240和120 bp 两条片段。本研究检测到两种基因型（图1）：AA基因型（360 bp）和AG基因型（360，240和120 bp），未检测到GG基因型。PCR产物经测序进一步验证（图2）。

图1 TSP-1不同基因型PCR产物酶切电泳图 [1：DNA Marker；2、3、4、6：AA基因型（360 bp）；5：AG基因型（360、240和120 bp）]

图2 PCR产物测序图（A部分显示为AA基因型，箭头提示该位点呈A/A单峰；B部分显示为AG基因型，箭头示该位点呈A/G双峰）

2.3 TSP-1基因多态性分布及其与ACS的关系研究结果显示，TSP-基因AG基因型频率在ACS组和对照组分别为1.5%和0.6%（P=0.43），G等位基因频率在两组间的分布也无显著性差异（0.7% vs. 0.3%，P=0.43）（表2）。Logistic回归分析显示，调整吸烟、高血压、糖尿病、TG及HDL-C等因素后，TSP-1基因AG基因型与ACS无显著相关性（OR=2.36；95%CI：0.46～12.48；P=0.46）。

3 讨论

TSP-1是一种多结构域及多功能的细胞外基质糖蛋白，可由激活的血小板α颗粒、单核细胞、平滑肌细胞和内皮细胞等合成分泌，参与调节平滑肌增值与迁移、内皮细胞凋亡、血小板聚集、血栓形成及血管新生等生物学过程[2-5]。TSP-1在ACS动脉粥样硬化的形成及损伤过程中发挥重要作用，其遗传多态性对动脉壁中的重要事件具有潜在意义[6,7]。

TSP-1基因定位于15号染色体q15，编码1170个氨基酸，包括21个外显子。其多态性位点A2210G位于第13外显子，该位点上发生A→G碱基改变，从而导致蛋白链的第700位氨基酸由天冬酰胺变为丝氨酸（700N→S）。GeneQuest研究中，Topol等[1]发现TSP-1 N700S多态性与早发心肌梗死的危险性显著相关。有学者进一步研究表明，TSP-1蛋白第700位氨基酸N→S替代可引起其钙结合域对钙离子的亲活力下降，进而增加了TSP-1致血小板聚集和释放功能，这可能是其促进心肌梗死发生的可能机制[8]。而之后日本、荷兰等人群的研究却未能重复GeneQuest研究结果，TSP-1 N700S变异在不同种族人群中的分布差异很大[9-12]。本研究表明TSP-1 N700S不是中国人群常见的单核苷酸多态性位点，700N→S变异频数明显低于西方人群（0.3% vs. 11%）[5]，且未发现其与ACS的发生显著相关。各研究报道不一致可能与以下因素有关，如研究人群种族不同、遗传背景差异、对象纳入标准差异以及环境因素影响等。当然，本研究的设计和方法亦有一些局限性，如样本量偏小，且未进行TSP-1功能学研究。

表2 TSP-1 A2210G基因型和等位基因频率的分布

综上所述，不同种族人群的TSP-1 N700S多态性分布差异较大，中国人群700N→S变异发生率明显低于西方人群，且与ACS发病无显著相关性。本研究结果进一步补充了冠状动脉疾病TSP-1基因数据库信息。TSP-1 N700S多态性与ACS的确切联系尚需从多个不同的大规模人群进一步探讨。

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本文编辑：刘璐鑫，田国祥

Polymorphism of thrombospondin-1 gene in patients with acute coronary syndrome

GAO Lei*, HE Guoping, QIAN Yi-chao, QI Chuan-ping.*Department of Cardiology, Affiliated Wujin Hospital of Jiangsu University, Changzhou 213002, China.

GAO Lei; E-mail: gaolei801201@sina.com

ObjectiveTo analyze the correlation between polymorphism of the thrombospondin-1 (TSP-1) gene A2210G (N700S) and acute coronary syndrome (ACS) in the Chinese population.MethodsA case-control study was conducted. By polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism analysis, the TSP-1 A2210G polymorphism was analyzed in 412 patients with ACS (ACS group) and 337 control subjects free from coronary artery disease (control group) from Affiliated Wujin Hospital of Jiangsu University between June 2005 and November 2010.ResultsThe frequencies of AG genotype were 1.5% and 0.6% in ACS group and control group, respectively (P=0.43). None of the homozygotes were detected for the G allele. The prevalence of the G allele was not significantly different between ACS group and control group (0.7% vs. 0.3%, P=0.43). Result of multivariate logistic regression analysis showed that AG genotype of TSP-1 gene had no significant correlation with ACS (OR=2.36；95%CI：0.46～12.48；P=0.46).ConclusionThe TSP-1 N700S variant shows a low prevalence in the Chinese population and fails to associate with an altered risk of ACS.

Thrombospondin; Genetic polymorphism; Acute coronary syndrome

R541.4

A

1674-4055(2016)12-1449-03

常州市卫生局重大科研项目(ZD200601)

1213002 常州,江苏大学附属武进医院心内科;2213002 常州,江苏大学附属武进医院检验科

高磊,E-mail:gaolei801201@sina.com

10.3969/j.issn.1674-4055.2016.12.10