HPV感染及DAPK甲基化与宫颈病变的相关性研究

李玲，谢明水，刘杨，张秋莹

(湖北医药学院附属随州医院医学检验科，湖北 随州 441300)

HPV感染及DAPK甲基化与宫颈病变的相关性研究

李玲，谢明水，刘杨，张秋莹

(湖北医药学院附属随州医院医学检验科，湖北 随州 441300)

目的研究人乳头瘤病毒(HPV)感染及死亡相关蛋白激酶(DAPK)甲基化与宫颈病变的相关性。方法选择2012年6月至2015年6月在我院接受诊治的310例疑似宫颈病变患者作为研究对象。依照阴道镜的宫颈活检结果进行分组，主要包含宫颈上皮内瘤变Ⅰ～Ⅲ级(CINⅠ～Ⅲ)186例，鳞状细胞癌(SCC)36例，以及未发现恶性细胞及上皮内病变细胞(NILM)88例。检测并对比各组受试者不同宫颈病变对应的HPV感染情况、DAPK甲基化率，分析二者与宫颈病变的相关性。结果310例不同的宫颈病变患者中，共检出212例高危HPV感染阳性者，阳性率为68.39%；伴随宫颈病变程度进展，高危HPV感染阳性率亦表现为增高趋势[NILM：31.82%(28/88)；CINⅠ：69.51%(57/82)；CINⅡ：85.25%(52/61)；CINⅢ：90.70%(39/43)；SCC：100.00%(36/36)]，组间差异有统计学意义(P＜0.05)；59例DAPK甲基化阳性者，甲基化率为19.03%；伴随宫颈病变程度进展，宫颈组织DAPK基因甲基化率亦表现为增高趋势[NILM：3.41%(3/88)；CINⅠ：9.76%(8/82)；CINⅡ：13.11%(8/61)；CINⅢ：44.19%(19/43)；SCC：58.33%(21/36)]，组间差异有统计学意义(P＜0.05)。根据Pearson法分析相关性可知，HPV感染与DAPK甲基化及宫颈病变均呈正相关(P＜0.05)，DAPK甲基化与宫颈病变亦呈正相关(P＜0.05)。结论HPV感染及DAPK甲基化均与宫颈病变具有紧密联系，临床诊断与治疗时均可对其进行持续监测，值得关注。

HPV感染；DAPK甲基化；宫颈病变；相关性

宫颈癌是一种严重危害女性身体健康的恶性疾病，其发病率居女性恶性肿瘤的第二位。目前研究表明，宫颈癌是由宫颈上皮内瘤变逐步发展形成。在宫颈癌发生和发展中人乳头瘤病毒(HPV)感染起到重要作用[1-2]。有报道显示，HPV感染女性宫颈癌发病率显著升高[3]。除此之外抑癌基因失活和甲基化在宫颈癌发生和发展中也起到了重要作用。其中死亡相关蛋白激酶(DAPK)基因是一种凋亡正相性调节因子，当其失活时，细胞程序性的死亡过程被阻断，致使细胞寿命增长，诱使肿瘤发生。对于正常的宫颈组织，基因启动子有关区域含有的CpG岛处在非甲基化亦或是低甲基化的状态，但在恶性宫颈病变组织中，CpG岛甲基化情况明显增加，与之有关的基因表达亦随之缺失[4]。本文通过分析HPV感染及DAPK甲基化与宫颈病变的相关性，旨在为临床诊治宫颈病变提供理论数据支持，现报道如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2012年6月至2015年6月在我院接受诊治的310例疑似宫颈病变患者作为研究对象。所有患者均实施TCT及阴道镜检查，年龄30～55岁，平均年龄(42.5±2.3)岁。依照阴道镜的宫颈活检结果进行分组，主要包含宫颈上皮内瘤变CINⅠ级82例，CINⅡ级61例、CINⅢ级43例，鳞状细胞癌(SCC)36例，以及未发现恶性细胞及上皮内病变细胞(NILM)88例。排除标准：(1)有其他类型的恶性肿瘤者；(2)提取标本前接受过放、化疗或者手术治疗者。本次研究涉及的相关检测均已获得患者同意，并由医院伦理委员会会议审批后批准。

1.2 研究方法

1.2.1 HPV-DNA检测 将已制好的细胞保存液进行混匀，并吸取1 mL的细胞悬液，放置在1.5 mL的离心管内，离心5 min，弃去上清液。往细胞沉淀内加进1 mL的细胞洗涤剂(Cell Washing Solution)，再将细胞沉淀行充分悬浮，离心5 min，弃去上清液。再加进200 μL的Fast Extract Solution，进行摇动或者涡旋振荡，再充分悬浮得到的细胞沉淀。实施15 min的95℃水浴或者金属浴，每5 min摇匀1次。离心3 min，将上清用作PCR扩增，在-20℃下保存剩余的基因组，若再次使用，则需融化摇匀并离心3 min。利用紫外分光光度仪检测提取DNA分别在260 nm、280 nm、320 nm时的吸光度(OD)，DNA浓度为(OD260-OD320)×稀释倍数×0.05 μg/μL。将扩增混合液及Taq酶以89:1的比例配成PCR反应体系，总量100 μL。依据标记，朝各PCR管内加进10 μL对应样本DNA亦或是阳性对照流池内控品。混匀、离心，使液体收集于PCR管底部。已配制好的PCR扩增体系置入PCR扩增仪内，依照下列程序设置好扩增条件：(1)50℃2 min，94℃4 min；(2)94℃30 s，48℃45 s，72℃20 s，28个循环；(3)94℃30 s，65℃45 s，72℃20 s，25个循环；(4)4℃保存。扩增完成后实施检测。

1.2.2 DAPK甲基化检测 进行DNA变性处理，DAPK基因引物设计：M：正义链：5'-GGATAGTCGGAT CGAGTTAACGTC-3'，反义链：5'-CCCTCCCAAACGC CGA-3'，产物大小为98 bp。U：正义链：5'-GGAGGATAGTTGGATTGAGTTAATGTT-3'；反义链：5'-CA

AATCCCTCCCAAACACCAA-3'，产物大小为106 bp。进行甲基化专一性PCR操作，经过上样和电泳、固定、银染、显影及定影处理后判断甲基化结果。

1.3 观察指标 对比不同宫颈病变对应的HPV感染情况，DAPK甲基化率，分析二者与宫颈病变的相关性。

1.4 统计学方法 应用SPSS18.0统计软件进行数据分析，计数数据比较采用χ2检验，应用Pearson相关分析进行数据相关分析检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同宫颈病变对应的HPV感染情况对比 310例不同的宫颈病变患者中，共检出212例高危HPV感染阳性者，阳性率为68.39%。伴随宫颈病变程度进展，高危HPV感染阳性率亦表现为增高趋势，组间比较差异有统计学意义(χ2=89.043，P=0.000)，见表1。

表1 不同宫颈病变对应的HPV感染情况对比[例(%)]

2.2 不同宫颈病变的DAPK甲基化率对比 310例不同的宫颈病变患者中，共检出59例DAPK甲基化阳性者，甲基化率为19.03%。伴随宫颈病变程度进展，宫颈组织DAPK基因甲基化率亦表现为增高趋势，组间比较差异有统计学意义(χ2=73.642，P=0.000)，见表2。

表2 不同宫颈病变的DAPK甲基化率比较[例(%)]

2.3 HPV感染及DAPK甲基化与宫颈病变的相关性 根据Pearson法分析相关性可知，HPV感染与DAPK甲基化及宫颈病变均呈正相关，DAPK甲基化与宫颈病变亦呈正相关(P＜0.05)，见表3。

表3 HPV感染及DAPK甲基化与宫颈病变的相关性

3 讨 论

近年来发现，女性的宫颈病变的主要原因包括HPV感染、性生活活跃以及性传播疾病等多种因素，患者通常会经历CINⅠ～Ⅲ以及原位癌和宫颈浸润癌等诸多阶段[5]。但不是所有的宫颈病变患者均存在HPV感染，而HPV感染者也不一定发生宫颈病变。因此宫颈病变过程中还伴有其他因素的改变，其中抑癌基因失活和异常甲基化起到重要作用。DAPK时定位于9q34.1的一种钙调节蛋白依赖性激酶，具有丝氨酸/苏氨酸激酶活性，也是细胞凋亡的重要基因。当DAPK基因的异常甲基化，可导致其表达产物缺失，细胞凋亡受阻，利于肿瘤细胞的增殖[6]。因此，分析HPV感染及DAPK甲基化与宫颈病变之间的联系对于患者宫颈病变的监测诊断具有重要作用。Yang等[7]通过对85例宫颈癌标本的研究发现80%宫颈癌标本存在DAPK甲基化，并认为，DAPK甲基化对于宫颈病变起到重要作用。

本研究通过研究分析后发现，310例不同的宫颈病变患者中，高危HPV感染的阳性率为68.39%，甲基化率为19.03%，低于Yang等[7]的报道，其原因主要是本研究选择病例为疑似宫颈病变，含有NILM和CIN者，因此DAPK甲基化率和HPV感染的阳性率较低。且根据Pearson法分析相关性可知，HPV感染与DAPK甲基化及宫颈病变均呈正相关，DAPK甲基化与宫颈病变亦呈正相关，提示在宫颈病变程度逐渐加重的患者群体中，HPV感染以及DAPK甲基化的症状均明显增加。符合Kietpeerakool等[8]的相关报道结果。究其原因，笔者认为这主要与以下两个方面的原因有关：在HPV感染方面，当前使用的测定技术可对HPV-DNA实施准确分型，HPV存在120多种亚型，其中6、11及42～44等亚型为低危型，通常不会诱发癌变，可引起CINⅠ等病变；而16、18及31等亚型为高危型，可诱发CINⅡ～Ⅲ型病变及宫颈癌。因此，对于宫颈病变程度逐渐加重的患者类别，HPV检测阳性率亦随之增高，从而准确地反映出癌前病变及宫颈癌。在DAPK甲基化方面，抑癌基因DAPK作为Ca2+钙调素依赖激酶，其可导致底物蛋白具有的丝氨酸/苏氨酸发生残基磷酸化。Chagas等[9]报道指出，DAPK表达水平的降低和多类肿瘤的进展及转移均密切相关。DAPK在各类细胞凋亡的信号通路中均可广泛存在，甚至在细胞凋亡初期即已被激活，活性亦能够持续到不可逆自毁时。DAPK甲基化可导致表达缺失，患者机体稳态失去平衡，细胞生长周期随之延长，并使肿瘤细胞发生无限增殖，因此宫颈病变的症状更加严重。因此，宫颈病变程度越重的患者发生DAPK甲基化的几率亦越大。刘晓婉等[10]报道称，DAPK基因的启动子区CpG岛发生的异常甲基化可能是导致此基因表达发生丢失的一个主要原因，而正常的宫颈鳞状上皮组织中一般不会发生此种甲基化状况。此外，在Wang等[11]和花敏慧等[12]的报道中亦可发现类似的结果。

综上所述，HPV感染及DAPK甲基化均与宫颈病变具有紧密联系，临床诊断与治疗时均可对其进行持续监测，值得关注。

[1]仲肇基,杨佳欣,曹冬焱,等.子宫颈脱落细胞中DAPK1、RAR-β和MGMT基因启动子的甲基化水平及其临床意义[J].中华妇产科杂志,2012,47(3):196-200.

[2]花敏慧,刘春花,张玉泉,等.宫颈癌中DAPKⅠ、RARβ甲基化与高危型HPV感染的相关研究[J].南通大学学报(医学版),2011,31 (2):134-136.

[3]Lim EH,Ng SL,Li JL,et al.Cervical dysplasia:assessing methylation status(Methylight)of CCNA1,DAPK1,HS3ST2,PAX1 and TFPI2 to improve diagnostic accuracy[J].Gynecol Oncol,2010,119 (2):225-231.

[4]娜仁.TCT与HPV检测在宫颈癌筛查中的应用体会[J].海南医学, 2014,25(17):2631-2631.

[5]玛依努尔·尼牙孜,刘晓婉,朱开春,等.维吾尔族妇女宫颈癌及癌前病变组织中死亡相关蛋白激酶启动子甲基化水平的研究[J].中华肿瘤杂志,2012,34(1):31-34.

[6]张金莉,王红英,杨昕,等.维吾尔族子宫颈鳞癌患者血浆中DAPK基因启动子甲基化分析[J].中国妇幼保健,2014,29(5):682-684.

[7]Yang HJ,Liu VW,Wang Y,et al.Detection of hypermethylated genes in tumor and plasma of cervical cancer patients[J].Gynecol Oncol, 2004,93(2):435-440.

[8]Kietpeerakool C,Kleebkaow P,Srisomboon J,et al.Human papillomavirus genotype distribution among thai women with high-grade cervical intraepithelial lesions and invasive cervical cancer:a literature review[J].Asian Pac J Cancer Prev,2015,16(13):5153-5158.

[9]Chagas BS,Comar M,Gurgel AP,et al.Association study between cervical lesions and single or multiple vaccine-target and non-vaccine target human papillomavirus(HPV)types in women from northeastern brazil[J].PLoS One,2015,10(7):e0132570.

[10]刘晓婉,马玉兰,昆多孜·乌赛那洪,等.DAPK甲基化及HPV感染与维吾尔族妇女宫颈病变的相关性研究[J].现代生物医学进展, 2013,13(21):4069-4072.

[11]Wang HY,Park S,Lee D,et al.Prevalence of type-specific oncogenic human papillomavirus infection assessed by HPV E6/E7 mRNA among women with high-grade cervical lesions[J].Int J Infect Dis, 2015,30(37):135-142.

[12]花敏慧,沈爱国,倪惠华,等.联合应用DAPKI、RARβ甲基化和高危型HPV检测筛查宫颈癌及癌前病变的研究[J].现代妇产科进展,2011,20(7):551-554.

Correlation analysis of HPV infection and DAPK methylation with cervical lesions.

LI Ling,XIE Ming-shui,LIU Yang,ZHANG Qiu-ying.Department of Clinical Laboratory,Suizhou Hospital Affiliated to Hubei Medical College,Suizhou 441300,Hubei,CHINA

ObjectiveTo study the correlation of human papillomavirus(HPV)infection and death-associated protein kinase(DAPK)methylation with cervical lesions.MethodsA total of 310 cases of patients with suspected cervical lesion,who admitted to our hospital from June 2012 to June 2015,were chosen as the research objects.According to the results of cervical biopsy of the cervix,these patients were divided into CIN group[186 cases of cervical intraepithelial neoplasia 1～3(CIN 1～3)],SCC group[36 cases of squamous cell carcinoma(SCC)],and NILM group[88 cases of malignant cells and intraepithelial lesions(NILM)].HPV infection statuses of different cervical lesions and DAPK methylation rate were compared,and the correlations of HPV infection and DAPK methylation with cervical lesions were analyzed.ResultsOf 310 cases of cervical lesions,212 cases of high risk HPV infection were identified,and the positive rate was 68.39%.With the progress of cervical lesions,the positive rate of high risk HPV infection also showed an increasing trend[NILM:31.82%(28/88);CIN-Ⅰ:69.51%(57/82);CIN-Ⅱ:85.25%(52/61);CIN-Ⅲ90.70%(39/ 43);SCC:100.00%(36/36)],and the differences between groups were statistically significant(P＜0.05).The methylation rate(59 cases with DAPK methylation)was 19.03%.Along with the progress of cervical lesions,the DAPK gene methylation rate of cervical tissue also showed an increasing trend[NILM:3.41%(3/88);CIN-Ⅰ:9.76%(8/82);CIN-Ⅱ: 13.11%(8/61);CIN-Ⅲ:44.19%(19/43);SCC:58.33%(21/36)],and the differences between groups were statistically significant(P＜0.05).Basing on the analysis of Pearson correlation,HPV infection was positively correlated with DAPK methylation and cervical lesions,and DAPK methylation was positively correlated with cervical lesions(P＜0.05).ConclusionHPV infection and DAPK methylation were closely associated with cervical lesions,which deserve to be monitored in the clinical diagnosis and treatment.

HPV infection;DAPK methylation;Cervical lesions;Correlation

R730.261

A

1003—6350（2016）10—1622—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.10.025

2015-08-26)

李玲。E-mail：hbsszsli@sina.com