舌鳞癌组织中VEGFR-3和淋巴管密度的表达及其临床病理意义

陈凯，王珂，潘宣，吴妹娟，马映霞，龚攀

（1.广东药学院附属第一医院口腔科，广东 广州 510080；2.广州医科大学附属肿瘤医院口腔科，广东 广州 510095）

舌鳞癌组织中VEGFR-3和淋巴管密度的表达及其临床病理意义

陈凯1，王珂1，潘宣1，吴妹娟1，马映霞1，龚攀2

（1.广东药学院附属第一医院口腔科，广东 广州 510080；2.广州医科大学附属肿瘤医院口腔科，广东 广州 510095）

目的 检测舌鳞癌组织中血管内皮生长因子受体3(VEGFR-3)和淋巴管密度(LVD)的表达水平，探讨其与患者临床病理指标的关系。方法选取2006年1月至2014年5月搜集的舌鳞癌标本60例和正常舌体标本12例，采用免疫组化染色法检测组织中VEGFR-3和LVD的表达水平，运用SPSS19.0软件处理实验数据，统计分析VEGFR-3与肿瘤LVD之间的相关性及临床病理意义。结果VEGFR-3在舌鳞癌组织中的高表达率为56.67%，对照组为25.00%；LVD在舌鳞癌组织中的高表达率为58.33%，对照组为16.67%；舌鳞癌中VEGFR-3和LVD的表达明显高于正常舌组织，差异均具有统计学意义(P＜0.05)。VEGFR-3和LVD的高表达与淋巴结转移(PVEGFR-3=0.043，PLVD=0.019)、临床分期(PVEGFR-3=0.006，PLVD=0.015）及生存状态(PVEGFR-3=0.028，PLVD=0.015)之间均具有相关性；VEGFR-3和LVD在舌鳞癌中具有正相关性(r=0.916，P＜0.001)。结论VEGFR-3和淋巴管密度与肿瘤的侵袭、转移及预后密切相关，可作为指导舌鳞癌诊治及判断预后的重要指标。

舌鳞癌；血管内皮生长因子受体3；淋巴管密度；淋巴结转移

舌癌是最常见的口腔癌，绝大多数为上皮来源的鳞癌，其发病率已呈现上升趋势，在全身恶性肿瘤中占据第6位[1-2]。由于舌体本身特殊的解剖结构和生理特性，舌鳞癌颈淋巴结转移率高，局部复发率高，往往危及患者生命；目前以手术为主、放化疗为辅的综合治疗方案已普遍运用于舌鳞癌的临床治疗，但舌鳞癌患者的5年总体生存率仍然停留在50%～60%[3-4]。

近年来，研究发现血管内皮生长因子受体3 (Vessel endotheliumgrowth factor receptor 3，VEGFR-3)及肿瘤淋巴管密度(Lymphatic vessel density，LVD)与肿瘤的淋巴结转移关系密切。本研究通过采用免疫组织化学技术检测VEGFR-3和淋巴管密度在舌鳞癌组织中的表达情况，进而探讨VEGFR-3、淋巴管密度与肿瘤淋巴结转移等临床病理参数之间的关系，为探索舌鳞癌淋巴结转移机制、提高舌鳞癌的治疗效果提供一定的实验依据。

1 材料与方法

1.1 标本 选取广东药学院附属第一医院口腔科2006年1月至2014年5月病理科收集的舌癌切除及颈淋巴清扫术患者的石蜡包埋标本60例为实验组；选取正常舌黏膜12例(外伤后手术切除组织)为对照组。所有病例均有完整的临床资料及随访记录，诊断标准按照2010年国际抗癌协会(UICC)制定的舌鳞癌的TNM分类和临床分期。

1.2 试剂和方法 所有样本均经10%福尔马林液固定，常规石蜡包埋。将实验石蜡标本进行连续切片，厚为4 μm，免疫组织化学染色法检测VEGFR-3、LYVE-1的表达，各项步骤均按试剂说明书操作，严格控制实验条件。羊抗人LYVE-1多克隆抗体购自R&D公司；羊抗人VEGFR-3多克隆抗体购自北京中杉生物技术公司；GTVisionTMⅢ抗羊免疫组化检测试剂盒购自上海基因公司。

1.3 结果判定 (1)VEGFR-3蛋白：VEGFR-3蛋白多表达于胞浆和胞膜中，胞浆和胞膜中有棕黄色颗粒沉着的细胞为阳性细胞。在染色均匀的肿瘤区，选取5个高倍镜视野(×400)，按照阳性细胞百分比及染色强度进行评估：依据阳性细胞所占比例0，1%～10%，11%～49%，50%～100%，分别计作0、1、2、3分；依据无染色，染色淡黄色、黄色、棕黄色分别计作0、1、2、3分；二者乘积作为总分，0～3分为低表达，4～9分为高表达。(2)淋巴管密度(LVD)：LYVE-1阳性染色为胞浆和胞膜棕黄色染色；在本实验中具有管腔结构的LYVE-1阳性阳性标记的淋巴管用于LVD的计数。首先在低倍镜下选择5个染色清晰、背景对照良好的区域，然后在200倍镜视野下记录脉管数目，取其均数作为该样本的淋巴管密度。根据本研究中LVD表达的具体情况，将LVD位于0～10之间者作为低表达组，而大于10者纳入高表达组。

1.4 统计学方法 应用SPSS19.0统计软件进行数据分析，计数资料比较采用χ2检验，Spearman等级相关分析肿瘤中VEGFR-3表达与肿瘤淋巴管密度的关系，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 VEGFR-3在正常组织及舌鳞癌中的表达情况 VEGFR-3阳性表达定位于舌鳞癌癌细胞质中，呈棕黄色染色颗粒(见图1、图2)。本实验中，VEGFR-3在舌鳞癌组中高表达34例，低表达26例，高表达率为56.67%，低表达率为43.33%；在对照组中，高表达3例，低表达9例，高表达率为25.00%，而低表达率为75.00%(见图3)。VEGFR-3在舌鳞癌中的高表达率明显高于在正常舌组织中的高表达率，差异有统计学意义(χ2=4.01，P=0.045)。

图2 舌鳞癌组织免疫组化染色VEGFR-3低表达(×400)

图3 正常舌组织免疫组化染色VEGFR-3低表达(×400)

2.2 LVD在正常组织及舌鳞癌中的表达情况 LYVE-1阳性表达定位于舌鳞癌组织中淋巴管内皮细胞的细胞质或者细胞膜中，呈棕黄色颗粒(见图4、图5)。本实验中，舌鳞癌组织中的淋巴管常由多个小的不成形的管腔构成网状结构，管腔呈塌陷或扩张状态。LVD在舌鳞癌组中高表达35例，低表达25例，高表达率为58.33%，低表达率为41.67%；在对照组中高表达2例，低表达10例，高表达率为16.67%，而低表达率为83.33%(见图6)。舌鳞癌组织中LVD的高表达率明显高于在正常舌组织中LVD的高表达率，差异有统计学意义(χ2=6.95，P=0.008)。

图4 舌鳞癌组织免疫组化染色LYVE-1低表达（200×）

图5 舌鳞癌组织免疫组化染色LYVE-1高表达(200×)

图6 正常舌组织免疫组化染色LYVE-1低表达(200×)

2.3 VEGFR-3表达、肿瘤LVD与临床病理参数的关系 VEGFR-3的高表达与淋巴结转移(P= 0.043)、临床分期(P=0.006)及生存状况(P=0.028)之间均具有相关性，而与患者的性别、年龄、肿瘤T分类及分化程度无关；肿瘤LVD的高表达与淋巴结转移(P= 0.019)、临床分期(P=0.015)、生存状态(P=0.015)之间均具有相关性，见表1。而VEGFR-3的高表达与肿瘤LVD的高表达呈正相关，Spearman等级相关系数为0.915(P＜0.01)。

表1 舌鳞癌组织LVD、VEGFR-3表达与患者临床病理特征的关系[例（%）]

3 讨 论

舌癌主要通过淋巴道转移，淋巴结转移是舌癌患者最重要的预后指标之一。但长期以来，由于缺乏特异的淋巴管内皮标记物，关于肿瘤淋巴结转移的具体过程和具体方式一直争论较多，对肿瘤淋巴转移的研究也远远落后于血管转移。近年来，一系列淋巴管内皮细胞特异性标记物和淋巴管生成特异性调控因子的相继发现，极大地加快了对淋巴管生成研究的速度。已有众多的实验研究证明，肿瘤组织中的淋巴管生成在肿瘤淋巴结转移过程中起着重要的作用[5-7]。淋巴管为肿瘤细胞的浸润和转移提供了直接通道，并与患者不良预后有关[8]。Liang等[9]在对直肠癌进行研究后发现：同无淋巴管浸润的肿瘤相比，在有淋巴管浸润现象的肿瘤中，其LVD明显增高，且瘤体的LVD与结直肠癌的转移呈正相关。苏震等[10]通过对膀胱癌的观察发现，肿瘤组织LVD明显高于正常组织，淋巴结转移组LVD高于无淋巴结转移组，浸润超过肌层组LVD高于浸润未超过肌层组。实验还得出结论：在膀胱癌的发生发展过程中，LVD的升高是一个不良信号，即正常组织在恶变的过程中淋巴管的生成加快，进而加速了组织的恶变进程，淋巴管生成与膀胱癌的形成及其侵袭转移密切相关。在本实验中，我们发现舌鳞癌组织中LVD的高表达率明显高于正常舌组织，而且肿瘤LVD的高表达与舌鳞癌的淋巴结转移、临床分期及患者的生存状态均具有相关性，这和上述学者的研究结果基本一致。

VEGFR-3是一种酪氨酸激酶受体，结构上由胞外区、跨膜区及胞内区组成。在正常的成人个体中，VEGFR-3几乎只特异性地表达在淋巴管内皮细胞上。VEGFR-3与VEGF-C/D结合后发挥其生物学效应：诱导脉管内皮细胞的增殖和迁移，调控淋巴管的生成，进而调控肿瘤的生长转移。目前大多数学者都认为，VEGF-C/D-VEGFR-3机制调控着淋巴管内皮细胞的增殖和淋巴管的生成[11]。Stearns等[12]研究发现在有前哨淋巴结参与的原发性肿瘤中，VEGFR-3的表达水平明显提高，通过抑制VEGFR-3的表达可能对阻断肿瘤的淋巴结转移具有重要的意义。卢壁辉等[13]通过对结肠癌的研究发现VEGFR-3在肿瘤组织中的表达显著增高，而且VEGFR-3的高表达与肿瘤的浸润深度、淋巴结转移具有相关性。在本实验中，我们发现VEGFR-3在舌鳞癌组织中的高表达显著高于正常组织，VEGFR-3的高表达与舌鳞癌的淋巴结转移明、临床分期及生存状况具有明显相关性；我们还发现VEGFR-3的高表达与肿瘤LVD存在正相关性。考虑VEGFR-3表达水平增高并与VEGF-C/D结合后，刺激新生淋巴管生成、改善管腔通透性及内外压力差，促进肿瘤细胞经淋巴管向远处转移。

VEGFR-3和LVD在舌鳞癌的发展过程中起着重要作用，二者的联合检测可以作为预测舌鳞癌淋巴结转移和指导临床诊治的重要指标。

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Expression of VEGFR-3 and LVD in tongue squamous cell carcinoma and their clinical pathological significance.

CHEN Kai1,WANG Ke1,PAN Xuan1,WU Mei-juan1,MA Ying-xia1,GONG Pan2.1.Department of Stomatology,the First Affiliated Hospital of Guangdong Pharmaceutical University,Guangzhou 510080,Guangdong,CHINA;2.Department of Stomatology,the Cancer Hospital of Guangzhou Medical University,Guangzhou 510095,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo investigate vascular endothelial growth factor receptor-3(VEGFR-3)and lymphatic vessel density(LVD)relationships with clinical pathological indicators through studying their expression in tongue squamous cell carcinoma.MethodsSixty cases of tongue squamous cell carcinoma(TSCC)and 12 cases of normal tongue were collected from January 2006 to May 2014,and the expression of VEGFR-3 and LVD in these cases were detected by immunohistochemical staining.SSPS19.0 software was used to process the experimental data and analyze the correlation between VEGFR-3 and LVD,and their clinical pathological significance.ResultsThe expression rate of VEGFR-3 in TSCC and normal tongue were respectively 56.67%and 25.00%(P=0.045).The expression rate of LVD in TSCC and normal tongue were respectively 58.33%and 16.67%(P=0.008).The expression of VEGFR-3 and LVD in TSCC were significantly higher than in normal tongue(P＜0.05).The expression of VEGFR-3 and LVD were significantly associated with lymph node metastasis(PVEGFR-3=0.043,PLVD=0.019),clinical stage(PVEGFR-3=0.006,PLVD=0.015)and living conditions(PVEGFR-3=0.028,PLVD=0.015).The expression of VEGFR-3 had a positive correlation with the expression of LVD(r=0.916,P＜0.001).ConclusionVEGFR-3 and LVD are closely correlated to invasion,metastasis and prognosis of TSCC.So they can be the important indicators for guiding the diagnosis and treatment,and judging the prognosis of TSCC.

Tongue squamous cell carcinoma(TSCC);Vascular endothelial growth factor receptor-3(VEGFR-3);Lymphatic vessel density(LVD);Lymph node metastasis

R739.86

A

1003—6350（2016）10—1575—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.10.009

2015-12-15)

广东省医学科研基金指令性课题项目(编号：C2015031)；广东药学院附属第一医院院内课题项目（编号：201218）；广州医科大学青年科研项目(编号：2014A37)

潘宣。E-mail：603200275@qq.com