HOXB6在裸鼠大肠癌肝转移模型抑癌机制的实验研究

张晓微，王艺，赵雪峰

(大连大学附属新华医院普通外科，辽宁大连116021)

HOXB6在裸鼠大肠癌肝转移模型抑癌机制的实验研究

张晓微，王艺，赵雪峰

(大连大学附属新华医院普通外科，辽宁大连116021)

目的研究HOXB6在裸鼠大肠癌肝转移模型抑癌机制及其前临床意义。方法采用基因重组质粒pcDNA6-HOXB6转染的HT29大肠癌细胞株建立裸鼠肝转移模型，随机分为两组，即HOXB6组和对照组。制模30 d后观察两组间转移瘤形成情况及生存情况。结果HOXB6组平均体质量、肝质量、肝转移评分及血性腹水生成率明显低于对照组，差异均有统计学意义(分别为20.04 g与23.08 g，P＜0.01；1.54 g与2.22 g，P＜0.01；0.60与3.80，P＜0.01；0与80.0%，P＜0.05)；两组生存曲线分析显示，HOXB6组生存率明显高于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)。结论HOXB6可抑制裸鼠大肠癌肝转移的形成，且可作为肿瘤转移的评判指标。

HOXB6；裸鼠；大肠癌；肝转移

同源盒基因(HOX基因)是调节胚胎的发育和分化的主宰基因，近期研究报道其对胃肠道恶性肿瘤的发生发展中发挥着重要的作用[1]。其中，HOXB6与大肠癌的发生、发展和转移有关[2]。同时，还深入到大肠癌患者的早期诊断、术前分期判断及预后的评估中[3]。但真正推广于临床肿瘤标记物，有待于大样本的调查和前临床试验作为铺垫。本研究首次采用裸鼠大肠癌肝转移模型来探讨HOXB6的抑癌机制及其前临床试验中的意义，进一步明确HOXB6在大肠癌肝转移中的地位，以期为制备HOXB6相关抗体来针对大肠癌进行敏感性靶向治疗和肿瘤的预防提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与材料HT29人大肠癌细胞株购自美国ATCC细胞研究所。转染基因重组质粒pcDNA6-HOXB6及pcDNA6-scramble的大肠癌细胞由大连大学附属新华医院中心实验室完成。RPMI-1640和新生胎牛血清购自Invirtogen，10只6周龄雌性BALB/c裸鼠购自大连医科大学动物研究中心。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及悬液制备常规无菌培养已转染的HT29人大肠癌细胞株，细胞融合至90%以上时收集细胞并在显微镜下计数，调整至细胞浓度为5×107/ml。细胞混悬液置于冰中待接种。

1.2.2 模型设计实验动物购入后在模型前1周防止进行任何刺激性操作。裸鼠共10只，随机划分成HOXB6组5只和对照组5只，制模后观察4周。

1.2.3 大肠癌肝转移模型的建立[4]选择异氟醚进行全身麻醉。取5 mm小切口入腹后轻轻牵出大网膜和脾脏。选择脾脏被摸中点，采用G31注射器进针2 mm左右，稳定注入已转染的HT29人大肠癌细胞混悬液100 μl，止血纱布压迫注射部位前可见其周围有颜色改变及肿胀。数分钟后离断脾脏动静脉，从腹腔中移除脾脏，逐层关腹。

1.2.4 大肠癌肝转移评分标准肝转移评分标准如下，0：没有肝转移；1：肝脏浸及为轻微，浸润范围＜0.5 cm2；2：肝脏浸及为轻度，浸润范围0.5～1.0 cm2；3：肝脏浸及为中度，浸润范围1.0～2.0 cm2；4：肝脏浸及为重度，浸润范围2.0 cm2以上。

1.2.5 实验观察指标及项目每天常规观察并记录裸鼠的一般状态。裸鼠出现频死前症状或观察期满4周时予以处死。处死后立即解剖观察腹腔内转移癌情况，具体记录裸鼠的体质量、肝质量、肝转移评分及是否存在血性腹水等，移除之肝转移病灶采取病理检查。

1.3 统计学方法应用SPSS14.0统计软件进行数据分析。计量数据以均数±标准差(±s)表示，组间比较采用t检验、计数资料采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HOXB6对裸鼠大肠癌肝转移模型的转移癌形成情况HOXB6组平均体质量、肝质量、肝转移评分及血性腹水生成率显著少于对照组，差异均有统计学意义(P＜0.01或P＜0.0)，见表1。大体观及纤维镜下结果显示，HOXB6组转移癌浸润生长缓慢，但对照组转移癌的肝内转移和局部浸润生长迅猛，见图1。

表1 两组裸鼠大肠癌肝转移模型的转移癌形成情况比较(±s)

表1 两组裸鼠大肠癌肝转移模型的转移癌形成情况比较(±s)

组别肝转移分级无有体质量(g)肝质量(g) HOXB6组对照组检验值P值20.04±0.86 23.08±0.63 t=5.403 0.006 1.54±0.11 2.22±0.08 t=8.552 0.001 0.60±0.15 3.80±0.45 t=10.251 0.006 5(100.0) 1(20.0) 0(0.0) 4(80.0) χ2=6.667 0.016

图1 裸鼠大肠癌肝转移模型的HOXB6组和对照组在大体肉眼上和显微镜下改变。大体上主要观察有无血性腹水、腹膜种植转移及肝转移评分；显微镜下主要观察癌细胞的分布，放大倍数为100倍，其刻度标尺为100 μm.

2.2 HOXB6对裸鼠大肠癌肝转移模型的生存率情况每天观察裸鼠一般状态，饲养4周成功模型共10只，死亡5只。其中HOXB6组平均生存时间为3.94周，对照组平均生存时间为2.40周。HOXB6组累计生存率为80%(4/5)，对照组累计生存率为20%(1/5)。Live tables证实，HOXB6组4周累计生存曲线明显高于对照组，两组间比较差异有统计学意义(P=0.034)，见图2。

图2 HOXB6组和对照组裸鼠大肠癌肝转移模型的累计生存曲线

3 讨论

在大肠癌患者中肝转移非常常见，手术仍是最有效的治愈手段。然而，80%～90%的绝大多数肝转移灶在起初时是无法根治性切除的，故肝转移成为了大肠癌患者最主要的死亡原因[5]。随着分子生物学的进步，越来越多与大肠癌相关的生物标记物陆续被发现。在转移性大肠癌患者的治疗中添加生物靶向治疗，可使一部分患者获益，如何筛选这部分患者成为深受关注的话题[6-7]。但这一重要的课题远远满足不了疾病的多样化、异常化、变异化趋势。因此，新的肿瘤标记物的发现和肿瘤预防制剂的研发，对癌肿的防治皆为关键。

HOX基因是转录调控或多种生长因子通路的枢纽因子，可调节肿瘤细胞的增殖、分化及凋亡。近年来，对HOX基因的研究主要集中于发育过程中，而对于HOX家族的39个成员的前临床和亚临床的研究仍处于起步阶段，至今为止只有少量的证据提示HOX家族在肿瘤形成过程中的抑制或促进作用机制[8]。非常可惜的是，试图对HOX基因应用于临床，但对特异性HOX基因的变化被提示患者需要更加积极的诊治方案[9]。其中，HOXB6为抑癌基因，是与人胃肠黏膜发育及形态成密切相关的基因[10]。已研究发现，HOXB6还与结肠癌的发生、进展和转移有相关性。加上，HOXB6基因的检测只需结直肠镜活检中的微量的标本，此为HOXB6基因研究添加了一个重要的砝码。

癌肿远处转移具有高度的选择性和较强的器官特异性，例如大肠癌易发生肝转移和肺转移[11]。大肠癌肝转移机制的研究基础依然是建立稳定的转移模型。本研究选用了先天无胸腺和体内无T细胞的裸鼠，并选择了经脾注射法。此法能使癌细胞有充裕的时间转移到肝脏，并切除主要免疫器官之脾脏，也符合单向性肝转移模型的构思，更有助于研究单纯性肝转移。

本研究结果显示，HOXB6基因对大肠癌肝转移模型有明显的抑癌机制。对HOXB6组进行解剖观察发现转移性肝癌形成缓慢均衡，不伴有血性腹水及远处转移，且4周累积生存率明显高于对照组。在HOXB6组肝转移癌细胞的生长增殖能力鉴定中，发现其生长繁殖能力不抵于侵袭能力。另一种解释方法是，虽然HOXB6组的肝转移癌细胞具备较强的侵袭能力，可其生长增殖能力相比较差。我们的研究结果打破了传统的转移性肿瘤的生长主流，这一结局关系到HOXB6基因的抗转移作用。至于相关的抑制转移机理和具体的HOXB6基因传导通路有待于更进一步深入研究。

综上所述，HOXB6可抑制裸鼠大肠癌肝转移的形成，并且可作为肿瘤转移的评判指标。但有必要进行亚临床研究来证实其量化效果，同时要不断进行对HOXB6基因抗转移作用机理的研究。

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Tumor-suppressive mechanisms of HOXB6 in nude mice models of liver metastasis of colon cancer.

ZHANGXiao-wei,WANG Yi,ZHAO Xue-feng.Department of General Surgery,Xinhua Hospital Affiliated to Dalian University, Dalian 116021,Liaoning,CHINA

ObjectiveTo study the tumor-suppressive mechanisms of HOXB6 gene in nude mice models of liver metastasis of colon cancer and its preclinical significance.MethodsHT29 colon cancer cells transfected by recombinant vector pcDNA6-HOXB6 gene were used to establish nude mice models of liver metastasis of colon cancer.The models were divided into two groups:HOXB6 group and control group.The formation situation of metastatic tumor and the survival status of nude mice models in the two groups were studied 30 d after the establishment of models. ResultsThe mean body weight,liver weight,liver metastasis scores and bloody ascites rate of HOXB6 group were significantly less or lower than those in the control group(20.04 g vs 23.08 g,P＜0.01;1.54 g vs 2.22 g,P＜0.01;0.60 vs 3.80,P＜0.01;0 vs.80.0%,P＜0.05).Survival curves showed that the survival rate in HOXB6 group was significantly higher than that in the control group(P=0.034).ConclusionHOXB6 gene may inhibit the formation of liver metastasis of colon cancer in nude mices,and it can be regarded as an indicator for evaluating tumor metastasis.

HOXB6;Nude mice;Colon cancer;Liver metastasis

R-332

A

1003—6350（2016）01—0001—03

大连大学博士启动基金项目(编号：20151QL019)

赵雪峰。E-mail：zhaoxuefeng74@hamail.net