MS培养基成分调整对太行菊不定芽增殖与生长的影响

赵元增,单长卷,杨靖,孙海燕

（河南科技学院,河南新乡453003）

MS培养基成分调整对太行菊不定芽增殖与生长的影响

赵元增,单长卷,杨靖,孙海燕

（河南科技学院,河南新乡453003）

以太行菊不定芽为材料,通过调整MS基本培养基中的无机盐、有机物质与蔗糖的用量,研究MS培养基成分的变化对太行菊不定芽增殖和生长的影响.结果表明：与单独加倍KNO3或KH2PO4用量相比,同时加倍MS培养基中KNO3与KH2PO4用量更有利于太行菊不定芽的增殖与生长,不定芽分化数量多,增殖系数高；培养基中NH4NO3用量加倍,对太行菊不定芽增殖与生长并无明显的促进作用,不定芽生长较差,叶片扁平且小.去除MS培养基中的微量元素或用N6的微量元素代替MS培养基中的微量元素,致使太行菊不定芽分化数量减少.培养基中蔗糖质量分数过小或过大对太行菊不定芽的增殖与生长均不利,不定芽分化数量减少,增殖效率降低.综合而言,适宜太行菊不定芽增殖与生长的培养基是改良MS（KNO3与KH2PO4用量加倍）+6-BA（0.4 mg/L）+NAA（0.1 mg/L）+蔗糖（质量分数为2%）.

太行菊；不定芽；离体培养；增殖系数

太行菊[Opisthopappus taihangensis（Ling）Shih]为菊科太行菊属多年生宿根草本植物,为我国太行山区独有珍稀物种,仅分布于豫、晋、冀三省交界的太行山区.由于分布区域狭窄,生境独特,繁殖能力差,太行菊现处于濒危状态,已被列为国家珍稀濒危保护植物及河南省重点保护植物[1-2].与传统药用野菊相比,太行菊具有更好的保健或药用功效,其整株的开发利用潜力巨大[3-4].另外,作为菊花的野生近缘种,太行菊也是菊花杂交育种理想的遗传材料[5].近年来,出于对太行菊资源保护与综合开发的需要,对太行菊的遗传多样性[6-7]、生殖生理[8-11]、远缘杂交[12-16]等的研究和报道逐渐增多.在太行菊的组培研究中,研究者多采用MS培养基作为离体培养的基本培养基[17-20].由于太行菊多生长于海拔1 000 m左右的悬崖峭壁、裸露岩石的缝隙中,所处生境土壤稀少,有机质、全氮含量较低,钙含量较高[21],其生长发育对培养基基本成分的需求可能存在特殊性,组培中常用的MS培养基,其基本组成不一定完全适应太行菊的生长发育.为此,本文对MS基本培养基的无机盐、有机物、蔗糖用量进行了调整,探讨MS基本成分的组成变化对太行菊不定芽增殖与生长的影响,以便建立有效的太行菊离体繁育技术体系,为太行菊种质资源的保护和开发利用奠定基础,同时对太行菊的引种驯化与栽培也有指导意义.

1 材料与方法

1.1 试验材料

太行菊植株采自新乡市关山国家地质公园,接种材料为太行菊无菌不定芽.

1.2 培养基

1.2.1 大量元素用量调整保持MS基本培养基的其他成分不变,对NH4NO3、KNO3、KH2PO4用量做单独或组合加倍处理,配制Ⅰ-1（基本MS）、Ⅰ-2（NH4NO3加倍）、Ⅰ-3（KNO3加倍）、Ⅰ-4（KH2PO4加倍）、Ⅰ-5（KNO3与KH2PO4加倍）5种培养基.

1.2.2 微量元素与有机成分调整在改良MS培养基（仅KNO3与KH2PO4用量加倍,其他成分保持不变）的基础上,对培养基中的微量元素与有机成分作如下调整：Ⅱ-1（改良MS,CK）、Ⅱ-2（去掉全部微量元素）、Ⅱ-3（N6微量元素取代MS微量元素）、Ⅱ-4（去除MS有机成分,即维生素和氨基酸类）.

1.2.3 蔗糖用量调整在改良MS培养基（仅KNO3与KH2PO4用量加倍,其他成分保持不变）的基础上,配制Ⅲ-1～Ⅲ-6不同蔗糖质量分数（0、1%、1.5%、2%、3%、5%）的培养基.

以上所有培养基均添加6-BA、NAA和琼脂粉,添加后，3种成分的质量浓度分别为0.4 mg/L、0.1 mg/L和4.6 g/L.pH调整为5.8.除Ⅲ-1～Ⅲ-6培养基外,其他各培养基均添加蔗糖,添加后的蔗糖质量分数为2%.所有试剂均由上海晶纯生化科技股份有限公司（阿拉丁）提供,其中外源激素类试剂为细胞培养级,其他试剂均为分析纯（AR）.

1.3 试验方法

1.3.1 接种与培养选取长势、大小一致的太行菊不定芽块,将其切成1 cm3大小,然后将芽块分别接种于以上各培养基,每种培养基接种20瓶,每瓶接种3块.接种时不定芽块基部嵌入培养基,不定芽生长点外露.置于（25±1）℃,光周期12 h/d,1 500～2 000 lx光照强度下培养.

1.3.2 调查项目与方法接种后7 d定期观察、记录不定芽的增殖与生长状况.培养40 d时,记录每个处理的接种不定芽块总数、芽块大小、不定芽长势（不定芽的叶色、叶片长度、叶片枯死情况等）等结果.然后将增殖后的不定芽块切割成与接种时的一致大小（1 cm3）,统计各处理增殖后芽块的分割总块数,并计算各处理的增殖系数：不定芽增殖系数=增殖后芽块的分割总块数/接种芽块总数.

2 结果与分析

2.1 培养基中MS大量元素用量调整对太行菊不定芽增殖与生长的影响

将MS基本培养基中的NH4NO3、KNO3、KH2PO4用量做单独或组合加倍调整后,太行菊不定芽在各培养基上的增殖与生长状况结果见表1.

由表1可知,与CK（Ⅰ-1）相比,在NH4NO3用量加倍（Ⅰ-2）和KH2PO4用量加倍（Ⅰ-3）的培养基上,虽然也有不定芽的分化,但不定芽增殖系数都低于CK,不定芽块偏小.从不定芽生长状况看,KH2PO4用量加倍的处理与CK相似,不定芽生长基本正常,只是稍大的叶片（叶片长度≥8 mm）微微泛黄,叶尖、叶缘呈水浸状,芽块中夹杂少量黄褐色至褐色的枯叶.但在NH4NO3用量加倍的培养基上,不定芽形态与CK存在明显差异：叶片扁平,叶面宽但纵轴短,其长度一般在7 mm以下,叶片卷曲相互层叠,使整个芽块外观扁平密实.

在KNO3用量加倍的培养基（Ⅰ-3与Ⅰ-5）上,不定芽增殖系数均高于CK,特别是在KNO3与KH2PO4用量同时加倍的培养基（Ⅰ-5）上,接种芽块分化产生大量的不定芽,无论是芽块大小还是不定芽增殖系数均达到最大.并且该培养基上的不定芽生长茁壮,叶色鲜绿,芽块中几乎没有黄化或枯死的叶片.

由此可知,培养基中的MS大量元素用量对太行菊不定芽的增殖与生长状况影响较大.与基本MS培养基相比,增大培养基中的KNO3用量,可促进太行菊不定芽的分化与生长,特别是KNO3与KH2PO4用量同时加倍时,对不定芽的增殖与生长的促进作用更为明显,离体培养的效果更好.但单独加倍培养基中的KH2PO4用量,并不能促进太行菊不定芽的增殖与生长.

2.2 培养基中微量元素与有机成分的改变对太行菊不定芽增殖与生长的影响

将培养基中的MS微量元素全部去除或用N6的微量元素替代,或将培养基中的MS有机成分全部去掉,经过这样简化处理的培养基,对太行菊不定芽增殖与生长的影响结果见表2.

由表2可知,与CK（Ⅱ-1）相比,若将培养基中的MS微量元素全部去除（Ⅱ-2）,将导致太行菊不定芽分化数量减少,芽块变小,不定芽增殖系数大大降低.并且该培养基上的不定芽长势变差,小的不定芽叶片卷曲,水浸透明,而较大的不定芽多数叶片黄化,芽块中出现大量黄褐色至褐色的枯死的叶片.当用N6微量元素代替MS微量元素（Ⅱ-3）后,与CK相比,不定芽分化数量减少,增殖系数降低.除存在少量黄褐色枯叶外,不定芽生长基本正常,且与CK相比,该培养基上的不定芽普遍较大,叶片狭长平展,较多的叶片长度可达15～20 mm.在有机成分全部去除的培养基（Ⅱ-4）上,芽块大小与不定芽生长状况与CK（Ⅱ-1）极为相似,只是在该培养基上,不定芽增殖系数有所降低,芽块中存在少量黄褐色的枯叶.

由此可知,在太行菊不定芽的增殖培养中,除去培养基中的MS微量元素既不利于不定芽的增殖,也不利于不定芽的生长.若以N6微量元素取代MS微量元素,虽然不定芽分化数量减少,但不定芽生长茁壮,芽体普遍较大.相对而言,去除培养基中的MS有机成分,对太行菊不定芽的增殖与生长影响相对较小.

2.3 培养基中不同蔗糖质量分数对太行菊不定芽增殖与生长的影响

培养基中蔗糖质量分数的不同对太行菊不定芽的增殖与生长影响较大,太行菊不定芽在各培养基上的增殖与生长状况见表3.

由表3可知,在不含蔗糖的培养基上,接种后的不定芽既未黄化、枯死,也无明显的增殖与生长,整个不定芽块基本为接种时的大小（直径10 mm左右）.当蔗糖质量分数低于2%时,随着培养基中蔗糖质量分数的提高,太行菊不定芽分化数量逐渐增多,增殖系数增大.当蔗糖质量分数为2%（Ⅱ-4培养基）时,芽块上分化产生大量的不定芽,不定芽的增殖系数达到最大（6.36）,并且在该培养基上,不定芽的生长状况也表现良好：不定芽叶片淡绿,叶片较大,叶片伸展正常,芽块中几乎无枯死叶片.当培养基中的蔗糖质量分数超过2%后,不定芽分化数量减少,增殖系数降低.特别是当蔗糖质量分数达到5%时,不定芽的分化与生长严重受阻,整个芽块呈淡黄色,芽块表面布满大量淡黄色的颗粒状小芽或点状突起,较大的不定芽数量稀少,并且叶片水浸状,黄色至黄褐色,叶片长度也仅有3～5 mm.

因此,在太行菊不定芽的离体培养中,培养基中过低或过高的蔗糖质量分数对不定芽的增殖与生长均不利.综合太行菊不定芽的增殖与生长状况,培养基中蔗糖质量分数以2%为宜.

3 小结与讨论

在植物的离体繁殖中,培养基中无机盐的种类和含量是影响培养物增殖与分化的重要因素之一.针对不同植物对无机盐的需求差异,研究者设计了不同类型的基本培养基,其中MS培养基是应用最广泛的一种基本培养基[22].从理论上讲,MS培养基中的无机盐浓度较高,微量元素及有机成分齐全而丰富,对多数植物的增殖培养而言,是较为理想的一种基本培养基[22].在对某种植物的无机盐需求未知的情况下,常常选择MS培养基作为离体繁殖的基本培养基.我们在前期试验中通过对比不同类型的基本培养基对太行菊不定芽增殖与生长的影响发现,对于太行菊的离体培养而言,MS培养基较其他培养基表现更好.但是,太行菊所处生境土壤稀少,有机质和全氮的含量较低,钙含量较高[21],其生长发育对无机盐的需求可能存在特殊性,组培中常用的MS培养基,其基本组成不一定完全适合太行菊的生长发育.缘于此,本文对MS培养基中的无机盐含量进行了调整,以探究培养基中不同的无机盐水平对太行菊不定芽增殖与生长的影响.试验结果表明,在MS培养基中其他成分含量保持不变的情况下,将培养基中KNO3和KH2PO4含量加倍,有利于太行菊不定芽的增殖与生长,并且KNO3与KH2PO4同时加倍的培养效果要比KNO3或KH2PO4单独加倍时的效果好.在本文的试验范围内,将MS培养基中KNO3与KH2PO4用量同时加倍处理,对太行菊不定芽的增殖与生长是最适宜的.

在一般的离体繁殖中,培养基中使用的糖类多为蔗糖,其质量分数一般为3%[22].由于蔗糖是培养基中使用量最大的试剂,从降低离体繁殖的成本考虑,在不影响离体培养效果的前提下,蔗糖使用量越低越好.在前期的预备试验中,当培养基中的蔗糖质量分数高于3%时,太行菊不定芽的增殖与生长状况变差,本文的研究结果也证实,当蔗糖质量分数达到5%,太行菊不定芽的分化和生长受到严重抑制.为此,本文主要探讨了蔗糖质量分数低于3%时的情况.研究表明,培养基中蔗糖质量分数过低（2%以下）,不利于太行菊不定芽的增殖与生长,芽分化数量较少.当蔗糖质量分数为2%和3%时,不定芽的增殖与生长状况差别不大.但从节省培养基成本考虑,使用质量分数为2%的蔗糖进行太行菊的增殖培养更适宜.

对已分化成芽的培养物而言,有机物质有时也并非是必需的.N6基本培养基中的微量元素种类和含量较MS培养基少,从生产实际考虑,若能以N6微量元素取代MS的微量元素,或去掉MS培养基中的有机物质,无论是从节省生产成本还是从简化试验操作复杂性而言,都具有重要意义.本文研究结果表明,去除MS培养基中的微量元素,或以N6微量元素取代MS的微量元素均不利于太行菊不定芽的增殖；不过,就单个不定芽的生长而言,N6基本培养基的微量元素更适合太行菊不定芽的生长.去掉MS培养基中的全部有机物质,从不定芽增殖与生长的综合状况看,都是不利的.

综合而言,适合太行菊不定芽增殖和生长的培养基为：改良MS（KNO3与KH2PO4用量加倍）+6-BA 0.4 mg/L+NAA0.1 mg/L+蔗糖（质量分数为2%）.

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（责任编辑：邓天福）

Effect of composition adjustment of MS medium on adventitious buds propagation and growth of Opisthopappus taihangensis in vitro

ZHAO Yuanzeng,SHAN Changjuan,YANG Jing,SUN Haiyan
（Henan Institute ofScience and Technology,Xinxiang453003,China）

The effect of basic composition of MS medium under different content level based on the MS basic medium,including inorganic salts,organic substances and sucrose on Opisthopappus taihangensis adventitious buds proliferation and growth were investigated by using adventitious buds of O.taihangensis as test materials.The results showed that：The medium with double content of KNO3and KH2PO4based on the MS basic medium was more beneficial to the proliferation and growth of O.taihangensis adventitious buds compared with media doubling the content of KNO3or KH2PO4respectively.The number of O.taihangensis adventitious buds increased,and propagation coefficient improved on the adjusted medium with doubled content of KNO3and KH2PO4.The adjusted MS medium with the double content of NH4NO3had no positive effect on adventitious buds proliferation and growth,and the growth of O.taihangensis adventitious buds was inhibited in this medium.The number of adventitious buds decreased on media which micro-elements of MS basic medium were removed or substituted by micro-elements of N6 basic medium.It was not conductive to the proliferation and growth of adventitious buds at too high or low concentration of sucrose on a series of media.The number of O.taihangensis adventitious buds decreased,and propagation coefficient reduced on these medium.In conclusion,the adjusted medium with double content of KNO3and KH2PO4based on MS basic medium,added with 0.4 mg/L 6-BA,0.1 mg/L NAA and 2%sucrose was suitable for proliferation and growth of O.taihangensis adventitious buds.

Opisthopappus taihangensis；adventitious buds；culture in vitro；propagation coefficient

S567.23+9

A

1008-7516（2016）05-0007-05

10.3969/j.issn.1008-7516.2016.05.002

2016-05-22

河南省教育厅项目（14B210005）；河南科技学院博士科研启动基金项目（201010612002）

赵元增（1974―）,男,山东蒙阴人,博士,副教授.主要从事植物细胞工程与遗传育种研究.