miR-141表达异常对人肝癌细胞恶性生物学表型的影响*

刘　瑶，　贺兴波，　舒　涛，　黄才斌

(赣南医学院第一附属医院，江西 赣州 341000)



miR-141表达异常对人肝癌细胞恶性生物学表型的影响*

刘瑶，贺兴波，舒涛，黄才斌△

(赣南医学院第一附属医院，江西 赣州 341000)

[摘要]目的： 研究微小RNA-141(miR-141)在人肝癌细胞和正常胎肝细胞中的表达，同时分析miR-141表达异常对人肝癌细胞恶性生物学表型的影响。方法: 分别提取人肝癌细胞SMMC-7721和正常肝细胞HL-7702的总RNA，采用实时荧光定量PCR法检测miR-141的表达。采用脂质体介导的转染方法分别将miR-141 mimic转染SMMC-7721细胞，将miR-141 inhibitor转染HL-7702细胞；MTS试剂盒和BrdU-ELISA检测细胞增殖能力，流式细胞术检测转染前后细胞周期和凋亡率的变化。Transwell实验检测miR-141表达变化对细胞体外迁移能力的影响。结果: miR-141在SMMC-7721细胞中的表达较HL-7702细胞明显下降。与空白组、脂质体组和阴性对照组相比，转染25 nmol/L miR-141 mimic的SMMC-7721细胞中，细胞增殖速度减慢，S期细胞比例降低，凋亡细胞比例上升，细胞体外迁移能力下降；转染50 nmol/L miR-141 inhibitor的HL-7702细胞中，细胞增殖速度加快，S期细胞比例上升，凋亡细胞比例下降，细胞体外迁移能力增强。结论: miR-141在人肝癌细胞中表达下降，上调miR-141表达可抑制肝癌细胞体外增殖活性和迁移能力，影响细胞周期和凋亡。在肝癌发病进程中，miR-141可能扮演抑癌基因的角色。

[关键词]微小RNA-141； 肝细胞癌； 细胞增殖； 细胞周期； 细胞凋亡

miRNA是一类长度在20～25个核苷酸(nucleotide，nt)的内源性非编码单链小分子 RNA，在转录后水平调控超过1/3基因的表达，参与真核生物体内细胞增殖、分化凋亡、癌症等一系列生命活动[1]。miR-141隶属于miR-200家族，目前已有研究表明miR-141在结肠癌、前列腺癌等肿瘤中高表达[2-3]，但在胃癌组织中低表达[4-5]。肝细胞癌中miR-141的表达水平如何以及miR-141表达异常对肝癌细胞生物学活性的影响未见文献报道。本实验通过loss-of-function和gain-of-function技术分析miR-141表达改变对肝癌细胞增殖、细胞周期、凋亡和体外侵袭能力的影响。

材料和方法

1材料

人肝癌细胞株SMMC-7721和正常人肝细胞HL-7702由赣南医学院第一附属医院临床科研中心保存。miR-141和内参照U6 snRNA 特异逆转录及real-time PCR引物、miR-141 mimic和miR-141 inhibitor 购自广州市锐博生物科技有限公司；RNA 提取试剂TRIzol、转染试剂LipofectamineTMRNAiMAX和SYBR Green qPCR Super Mix购自Invitrogen；1640培养液和胎牛血清购自Gibco；MTS试剂盒购自Promega；BrdU-ELISA试剂盒购自Roche。细胞周期和凋亡检测试剂盒购自南京凯基生物发展技术有限公司；Transwell 小室购自Corning。

2方法

2.1细胞培养和miR-141表达水平的检测SMMC-7721细胞和HL-7702细胞在含10%胎牛血清的1640培养基(含1×105U/L青霉素和 100 mg/L链霉素)中培养，于37 ℃、5% CO2及饱和湿度条件下培养，每3 d传代1次。TRIzol法提取细胞的总RNA。紫外分光光度法上机检测RNA的浓度及纯度。逆转录总RNA后在荧光定量PCR仪上进行PCR扩增，使用U6作为内参照。

2.2细胞分组和瞬时转染 取对数生长期细胞，待融合度为30%～50%时进行转染。转染4 h后更换新鲜的完全培养基继续培养。SMMC-7721细胞分为空白(blank)组、脂质体(Lipofectamine,Lipo)组、25 nmol/L miR-141 mimic组和阴性对照(negative control，NC)组；HL-7702细胞分为空白组、脂质体组、50 nmol/L miR-141 inhibitor组和NC组。

2.3MTS实验检测细胞活力 分别用0.25%的胰蛋白酶消化并收集SMMC-7721细胞和HL-7702细胞，调整细胞浓度为1×108/L，取每孔100 μL接种至96孔板。脂质体转染操作同前所述。各组细胞分别在转染后24 h、48 h和72 h将对应96孔板换液并每孔加入100 μL 1640培养液及10 μL MTS。室温、5% CO2及饱和湿度条件下培养4 h，酶标仪读取490 nm处吸光度(A)值数据。

2.4BrdU 法检测细胞增殖 分别用0.25%的胰蛋白酶消化并收集SMMC-7721细胞和HL-7702细胞，调整细胞浓度为1×108/L，取每孔100 μL接种至96孔板，每组6个复孔。脂质体转染操作同前所述。各组细胞在转染后72 h每孔加入20 μL BrdU工作液，继续培养12 h后按照BrdU-ELISA 试剂盒操作说明书进行，酶标仪读取450 nm处吸光度(A)值数据，参照波长为690 nm。

2.5细胞周期和凋亡率分析分别用0.25%的胰蛋白酶消化并收集转染48 h后的各组细胞，调整细胞浓度为1×109/L。细胞周期分析时，制备的单细胞悬液用体积分数为70%的乙醇固定，4 ℃保存过夜，染色前用PBS洗去固定液； 加50 μL RNase A，37 ℃水浴30 min； 再加200 μL PI染色均匀，4 ℃避光30 min；上流式细胞仪检测，记录激发波长为488 nm处红色荧光。细胞凋亡率分析时，加入200 μL的binding buffer悬浮细胞；再加5 μL Annexin V-FITC混匀，之后加5 μL PI混匀，室温避光反应5～15 min；在1 h之内上流式细胞仪检测。

2.6Transwell实验检测细胞迁移能力Transwell小室外室加入0.6 mL 完全培养基，放入37 ℃培养箱平衡1 h以上。用0.25%的胰蛋白酶消化并收集各组细胞，用无血清的1640培养液调整细胞浓度为1×109/L；小室上室加入适量细胞悬液(每孔0.1 mL)；37 ℃培养24 h后取出小室，用PBS洗2遍，甲醇固定5 min。外室加入结晶紫(0.1%)染色，显微镜下观察并计数多个视野下的细胞。

3统计学处理

采用SPSS 17.0统计软件，实验数据以均数±标准差(mean±SD)表示，两组间均数比较采用两独立样本资料的t检验，多组间均数比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，组间两两比较采用SNK-q检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1SMMC-7721细胞和HL-7702 细胞中miR-141的表达水平

Real-time PCR结果显示人肝癌细胞SMMC-7721中miR-141表达水平显著低于正常人肝细胞HL-7702(P<0.05)，见图1。

2miR-141对细胞活力的影响

用MTS比色法检测SMMC-7721细胞和HL-7702细胞24～72 h的生长情况，发现SMMC-7721细胞在miR-141 mimic转染后各时点的吸光度值明显低于空白组、脂质体组和NC组(P<0.05)，72 h的细胞活力抑制率最明显。空白组、脂质体组和NC 组相比较，差异无统计学显著性。HL-7702细胞在miR-141 inhibitor 转染后各时点的吸光度值明显高于空白组、脂质体组和NC 组(P<0.05)，转染后48 h细胞活力明显增加。空白组、脂质体组和NC 组相比较，差异无统计学显著性(P>0.05)，见图2。

Figure 1.The expression of miR-141 in SMMC-7721 cells and HL-7702 cells measured by real-time PCR. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsHL-7702．

图1Real-time PCR检测2株细胞中miR-141的表达

3BrdU-ELISA 法检测miR-141对细胞增殖的影响

与空白组、脂质体组和NC组相比，miR-141 mimic转染能显著抑制SMMC-7721细胞体外增殖速度(P<0.05)。与空白组、脂质体组和NC 组相比，miR-141 inhibitor转染能显著加快HL-7702细胞体外增殖速度(P<0.05)，见图3。

Figure 2.The viability of SMMC-7721 cells and HL-7702 cells measured by MTS assay. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsmimic;#P<0.05vsinhibitor．

图2MTS检测miR-141表达变化对2株细胞活力的影响

Figure 3.The proliferation of SMMC-7721 cells and HL-7702 cells measured by BrdU-ELISA. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsmimic;#P<0.05vsinhibitor．

图3BrdU-ELISA检测miR-141表达变化对2株细胞体外增殖能力的影响

4miR-141对细胞周期和凋亡的影响

流式细胞术检测结果表明，与空白组、脂质体组和NC组相比，SMMC-7721细胞在miR-141 mimic 转染后72 h G0/G1、S和G2/M期细胞分布发生了改变，S期细胞比例下降，G1期细胞比例上升，细胞凋亡率上升。而HL-7702细胞在miR-141 inhibitor转染后72 h,S期比例上升，G1期细胞比例下降，细胞凋亡率下降，见图4、5。

Figure 4.The cell cycle of SMMC-7721 cells and HL-7702 cells analyzed by flow cytometry. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsmimic;#P<0.05vsinhibitor．

图4流式细胞术检测miR-141表达变化对2株细胞细胞周期的影响

5miR-141对细胞体外迁移能力的影响

SMMC-7721细胞在miR-141 mimic转染后，体外迁移能力明显下降，穿膜细胞数减少，差异有统计学显著性(P<0.05)，见图6。而HL-7702细胞在miR-141 inhibitor转染后，体外迁移能力明显增强，穿膜的细胞数增加，差异有统计学显著性(P<0.05)，见图7。

讨论

原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是一种严重威胁人类健康的疾病，死亡率居恶性肿瘤第3位，全世界每年新发肝癌患者近63万，其中55%发生在我国[6]。大多数肝癌患者在发现症状时，已届病程的中晚期阶段，错过了手术治疗的最佳时机。过去人们对HCC的研究多集中在寻找肿瘤相关基因，分析基因突变后对肝癌恶性生物学表型及细胞信号通路的影响。现已有学者分别从不同角度深入探讨肿瘤的发病机制,比如：启动子区域CpG岛的甲基化/去甲基化导致的基因表达沉默/激活；泛素化、磷酸化等蛋白质翻译后化学修饰导致的蛋白功能活化/钝化；miRNA转录调控靶mRNA表达等。

miRNA是一类短小的非编码RNA，由较长的初级转录物分别经核酸酶Drosha和Dicer的剪切加工而产生的，随后以相对低的稳定性组装进RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex，RISC)，通过碱基互补配对结合的方式识别靶mRNA。当miRNA 5’端第2位到第 8位核苷酸序列构成的种子区域与靶mRNA 3’非翻译区碱基完全互补时，miRNA发挥类似小干扰RNA的功能，引导RISC降解靶mRNA；如果不完全互补则阻遏靶mRNA的翻译[7]。

Figure 5.The apoptotic rate of SMMC-7721 cells and HL-7702 cells detected by flow cytometry. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsmimic;#P<0.05vsinhibitor．

图5流式细胞术检测miR-141表达变化对2株细胞凋亡的影响

目前发现人类基因组编码近700个miRNA，约50%分布在易发生染色体断裂、扩增及融合的肿瘤相关基因组区域或脆性位点[8-9]。国内外学者应用生物芯片技术，在多种肿瘤组织中筛选出表达异常的miRNA，并对其功能和作用靶点进行了一系列研究[10-11]。miR-200家族是近年来研究比较集中的热点，miR-141作为其中的一员，在维持上皮细胞表型稳定方面发挥重要作用，但当其表达失调时可促进细胞表型上皮-间质转换并导致上皮来源肿瘤的增殖、侵袭、转移[12-13]。已有文献报道外周血中miR-141的高表达与结肠癌患者远处转移、预后不良相关[2]。Shinozaki等[4]的研究却发现miR-141在胃癌组织和多种胃癌细胞中表达明显减少。鉴于miR-141在消化系统肿瘤中表达的差异性，我们认为有必要对原发性肝细胞癌中miR-141的表达情况进行分析。

通过实时荧光定量PCR检测，我们发现肝癌细胞株SMMC-7721中miR-141表达水平显著低于正常人肝细胞HL-7702。这和我们前期检测的临床切除肝癌和癌旁组织石蜡切片中miR-141的表达情况一致，且miR-141表达下调的程度与肝细胞癌恶性程度、肿瘤分化程度以及AFP有关，miR-141的表达随着临床分期增加而下调，分化程度越差、AFP表达越高的肝细胞癌组织中的miR-141的表达越低。为了进一步从体外水平研究miR-141表达异常对肝癌细胞株生物学活性的影响，我们通过gain-of-function技术上调肝癌细胞、loss-of-function技术下调正常肝细胞中miR-141的表达，SMMC-7721细胞在转染miR-141 mimic后各时点的增殖抑制率均显著上升，细胞周期S期比例下降，G1期比例上升，凋亡率上升，细胞体外迁移能力明显下降，穿膜细胞数明显减少;HL-7702细胞在miR-141 inhibitor 转染后各时点的增殖率均显著上升，细胞周期S期比例上升，G1期比例下降，凋亡率下降，细胞体外迁移能力明显增强，穿膜细胞数明显增多。

Figure 6.The migration of SMMC-7721 cells detected by Trans-well assay (×200). Mean±SD.n=3.*P<0.05vsmimic．

图6Transwell检测miR-141表达变化对SMMC-7721细胞体外迁移能力的影响

Figure 7.The migration of HL-7702 cells detected by Transwell assay (×200). Mean±SD.n=3.#P<0.05vsinhibitor．

图7Transwell检测miR-141表达变化对HL-7702细胞体外迁移能力的影响

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(责任编辑： 卢萍， 罗森)

Effect of abnormal expression of miR-141 on malignant biological behaviors of human hepatocarcinoma cells LIU Yao, HE Xing-bo, SHU Tao, HUANG Cai-bin

(TheFirstAffiliatedHospitalofGannanMedicalCollege,Ganzhou341000,China.E-mail:hcbgmu@163.com)

[ABSTRACT]AIM: To investigate the expression of microRNA-141 (miR-141) in human hepatocellular carcinoma (HCC) cell line SMMC-7721 and normal hepatocyte line HL-7702, and to analyze the effect of abnormal expression of miR-141 on the malignant biological behaviors of human hepatocarcinoma cells. METHODS: The RNA from SMMC-7721 cells and HL-7702 cells was extracted. SYBR Green real-time PCR was performed to detect the expression of miR-141. Synthetic miR-141 mimic and its negative control were transfected into the SMMC-7721 cells, and miR-141 inhibitor and its negative control were transfected into the HL-7702 cells by the method of Lipofectamine. After transfection, MTS assay and BrdU-ELISA were employed to evaluate the effect of miR-141 on the cell proliferation. Flow cytometry was used to detect cell cycle and apoptosis. The changes of migration ability were investigated by Transwell invasion assay. RESULTS: The expression of miR-141 in the SMMC-7721 cells was significantly lower than that in the HL-7702 cells (P<0.05). Compared with blank group, Lipofectamine group and negative control group, the proliferation of the SMMC-7721 cells transfected with 25 nmol/L miR-141 mimic was significantly inhibited in a time-dependent manner (P<0.05). The percentages of G1phase cells and early apoptotic rate were significantly increased when miR-141 was up-regulated, but the migration ability was inhibited (P<0.05). Compared with blank group, Lipofectamine group and negative control group, the proliferation of HL-7702 cells transfected with 50 nmol/L miR-141 inhibitor was significantly increased in a time-dependent manner (P<0.05). When miR-141 was down-regulated, the percentages of G1phase cells and early apoptotic rate were significantly decreased， but the migration ability was enhanced (P<0.05). CONCLUSION: miR-141 is down-regulated in human hepatocarcinoma cell line. Up-regulation of miR-141 will not only inhibit cell proliferation and migration ability, but also affect the cell cycle and apoptosis of SMMC-7721 cells. miR-141 may function as a tumor suppressor gene during HCC development.

[KEY WORDS]MicroRNA-141; Hepatocellular carcinoma; Cell proliferation; Cell cycle; Apoptosis

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.02.004

[中图分类号]R730.23

[文献标志码]A

通讯作者△Tel: 0797-8283981; E-mail: hcbgmu@163.com

*[基金项目]国家自然科学基金资助项目(No. 81160257); 江西省高校中青年教师发展计划专项资金资助项目(赣财教指[2012]132号)

[收稿日期]2015- 07- 15[修回日期] 2015- 11- 24

[文章编号]1000- 4718(2016)02- 0215- 06