A549细胞三维立体培养模型的建立及耐药机制

车　萍　季旭明　吴智春　王海瑞　欧阳兵

(山东中医药大学，山东　济南　250355)



A549细胞三维立体培养模型的建立及耐药机制

车萍季旭明吴智春王海瑞欧阳兵1

(山东中医药大学，山东济南250355)

〔摘要〕目的探讨肺腺癌A549细胞三维立体(3D)培养模型对顺铂(DDP)的耐药性及其黏附耐药机制。方法胶原培养条件下建立A549三维立体培养模型，MTT法检测平面(2D)培养和3D培养A549细胞敏感性。采用整合素β1激动剂(TSF)和抑制剂(MAB)干预，对其相关机制进行研究。结果A549细胞3D培养模型中可见细胞生长良好，细胞之间黏附形成典型的多细胞球。2D培养模型中A549细胞对DDP的IC50值为12.84 μg/ml；3D培养A549细胞对DDP的IC50是31.74 μg /ml，为2D培养的2.47倍。与空白对照组比较，DDP干预组及MAB+DDP组的抑制率明显升高(P<0.01)，TSF+DDP组有较显著差别(P<0.05)；与DDP干预组相比较，TSF+DDP组细胞抑制率明显降低(P<0.05)，MAB+DDP组明显升高(P<0.05)。结论胶原法成功建立A549细胞的3D培养模型。与2D培养相比，该细胞模型具有耐药的特性，其机制可能与促进整合素β1对细胞的黏附作用有关。

〔关键词〕三维立体培养；A549；DDP；整合素β1；黏附耐药

1山东省食品药品监督管理局

第一作者：车萍(1980-)，女，讲师，博士，主要从事方剂作用机制及药效物质基础研究。

化疗是晚期肺癌常用的姑息治疗方法之一，但肿瘤细胞与细胞外基质蛋白在黏附分子作用下产生的黏附耐药，可使肿瘤细胞对化疗药物的敏感性下降、疗效降低〔1，2〕。逆转黏附耐药是提高化疗疗效的关键，而在体外模拟肿瘤的体内微环境，构建具有实体瘤黏附耐药特性的细胞模型可为逆转黏附耐药研究提供实验平台。本研究拟建立肺腺癌A549细胞的三维立体(3D)培养模型，观察其对顺铂(DDP)的药物敏感性，并采用细胞黏附分子整合素β1的激动剂及抑制剂干预，以初步探讨其耐药机制。

1材料与方法

1.1实验材料细胞株：人肺腺癌A549细胞株，购于中国科学院生物物理所(北京)。试剂与药品：DDP，齐鲁制药有限公司；I型鼠尾型胶原，Sigma公司； RPMI1640，Hyclone公司；胰蛋白酶，北京Solarbio科技公司；新生牛血清，杭州四季青生物有限公司；噻唑蓝(MTT)，Sigma公司；TSF，Thermo公司；MAB，BD公司。实验仪器：倒置相差显微镜，德国Leica公司；超净工作台，中国苏净安泰公司；酶标仪，美国Molecular Devices公司。

1.2实验方法

1.2.1胶原培养液的配制〔3〕4℃条件下，将10倍常规浓度磷酸盐缓冲液(PBS)、新生牛血清、双蒸水、鼠尾胶原和2倍常规浓度的RPMI1640以1∶1∶1∶2∶5的比例迅速混匀，滴加NaOH溶液将混合液的pH值调至7.0，所得溶液即为胶原培养液。

1.2.23D细胞模型的建立取对数生长期的A549细胞，0.2%胰蛋白酶消化，调整细胞浓度至1×104/ml，制得细胞悬液。配制好的胶原培养液加入96孔板，每孔50 μl，室温放置15 min，使之成为半固定的锚定层；将胶原培养液与细胞悬液以1∶1比例迅速混匀，加入有锚定层的孔中，室温15 min，于培养箱内37℃孵育30 min，完全凝固成为细胞培养层，之后加入100 μl含10%新生牛血清的RPMI1640培养基，作为覆盖层。隔天换液一次。

1.3细胞形态学观察用倒置相差显微镜观察普通平面(2D)培养及3D培养条件下的不同时间点(0,2,4，6，8 d)的A549细胞形态学变化，拍照记录。

1.4不同培养条件下A549细胞对DDP的敏感性2D培养细胞，取其对数生长期，配成5×104/ml的细胞悬液，接种于96孔板，每孔200 μl(即每孔1×104个细胞)，置于37℃ CO2培养箱中培养。24 h后加入梯度浓度DDP 0、5、10、20、40、80 μg/ml,继续培养72 h。加入5 mg/ml的MTT 20 μl，继续孵育4 h。后除去每孔培养液，每孔加入150 μl DMSO，振荡5 min，使结晶完全溶解。酶标仪下检测吸光值，计算细胞增殖抑制率，并绘制曲线。3D培养细胞以每孔100 μl胶原培养液铺板，取1×104个细胞接种于96孔板。24 h后加入梯度浓度DDP，继续培养72 h。细胞增殖抑制率=(1-实验组OD值/对照组OD值)×100%。

1.5不同培养条件下整合素β1激动剂及抑制剂对A549细胞的作用另取对数生长期细胞，配成5×104/ml的细胞悬液，接种于96孔板，每孔200 μl进行三维培养。24 h后分为空白对照组(完全培养基组)，DDP干预组(取3D细胞模型的DDP的IC50浓度30 μg/ml)，TSF(整合素β1激动剂)+DDP组、MAB(整合素β1抑制剂)+DDP组，加入相应药物，继续培养72 h。后加入5 mg/ml的MTT 20 μl，继续孵育4 h。后除去每孔培养液，每孔加入150 μl DMSO，振荡5 min，使结晶完全溶解。酶标仪下检测吸光值，计算各组细胞增殖抑制率。

1.6统计学方法应用SPSS19.0软件，以GraphPad Prism5软件计算IC50值。多个样本间的比较采用单因素方差分析。

2结果

2.1细胞形态学观察在倒置相差显微镜下观察，2D培养细胞呈现梭形及多角形贴壁生长；而3D培养条件下，A549细胞呈圆形于胶原培养基中悬浮生长，细胞出现黏附的趋势，于培养第2天即可见由多个细胞黏附在一起呈团块状生长的现象，细胞团大小不一、形状不规则。随着培养时间的延长，细胞团有增大的趋势。见图1。

图1　2D培养及3D培养A549细胞不同时间点的形态观察(×200)

2.2MTT法检测细胞对DDP耐药性2D培养模型中A549细胞对DDP 5、10、20、40、80 μg/ml的细胞增殖抑制率分别是(33.48±1.98)%，(48.16±1.78)%，(58.06±2.21)%，(63.93±2.07)%，(79.67±1.75)%，IC50为12.84 μg/ml；3D培养模型中A549细胞对DDP的细胞增殖抑制率分别是(23.43±2.49)%，(34.93±3.14)%，(45.49±2.93)%，(53.72±4.09)%，(61.32±2.34)%，IC50为31.74 μg/ml；3D培养的A549细胞对DDP的IC50与2D平面培养的IC50的比值为2.47。

2.3MTT法检测整合素β1激动剂、抑制剂对3D培养的A549细胞的作用与空白对照组(0)比较，DDP干预组〔(49.30±3.50)%〕及MAB+DDP组〔(68.40±3.96)%〕的抑制率明显升高(P<0.01)，TSF+DDP组〔(30.00±4.76)%〕有较显著差别(P<0.05)；与DDP干预组比较，TSF+DDP组细胞抑制率明显降低(P<0.05)，MAB+DDP组明显升高(P<0.05)。

3讨论

肿瘤的微环境包括细胞因子、生长因子和各种细胞外基质等，是肿瘤发生、生长的局部环境〔4〕。肿瘤细胞与微环境相互作用的动态过程对恶性肿瘤的分化、转移、复发、疗效和预后有直接影响。如肿瘤细胞与细胞外基质蛋白在黏附分子的作用下产生的黏附耐药，直接导致肿瘤细胞对化疗药物的敏感性下降〔2〕，疗效降低。而2D培养细胞很难模拟体内的3D环境，这样就亟需一种细胞的3D培养模型来模拟人体内的微环境。

目前，耐药问题已经成为困扰临床化疗疗效的一大难题。研究证明〔5〕，小细胞肺癌细胞系通过整合素β1黏附于细胞外基质中的纤连蛋白、层黏连蛋白后，成瘤性明显增强，可抵抗顺铂等化疗药物的杀伤。

整合素β1是一种细胞表面黏附分子，可以和细胞外基质中多种成分结合，通过影响细胞增殖、抗凋亡等途径影响肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，增强肿瘤细胞的耐药表型〔6〕。阻断整合素β1介导的信号转导通路可在一定程度上逆转耐药现象，如Zhu等〔7〕在体外三维细胞培养中应用抗整合素β1单克隆抗体阻断整合素β1，可诱导乳腺癌细胞生长抑制、分化程度增高、极性恢复等表型逆转的现象；提示整合素β1介导黏附耐药，并通过信号转导通路参与凋亡抑制。

本实验结果提示，3D培养细胞对DDP的耐受可能与黏附耐药的产生有关，整合素β1参与了3D立体培养的A549细胞对DDP的黏附耐药。

综上所述，本文运用新型锚定法成功建立了A549细胞的三维立体培养模型，并且该模型显现出对DDP的耐药性，其机制可能与整合素β1介导的细胞间的黏附耐药相关。

4参考文献

1Jemal A,Bray F,Center MM,etal.Global cancer statistics〔J〕.CA Cancer J Clin,2011;61(2):69-90.

2Aoudjit F,Vuofi K.Integrin signaling inhibits paclitaxel-induced apoptosis in bream cancer cells〔J〕.Oncogene，2001;20(36):4995-5004.

3殷润婷，张伟，奚涛.改良的人乳腺癌细胞三维培养模型及药敏性考察〔J〕.药学进展，2014;38(1):46-50.

4Oue N,Aung PP,Mitani Y,etal.Genes involved in invasion and metastasis of gastric cancer identified by array-based hybridization and serial analysis of gene expression〔J〕.Oncology,2005;69(1):17-22.

5Rintoul RC,Sethi T.Extracellular matrix regulation of drug resistance in small-cell lung cancer〔J〕.Clin Sci(Lond),2002;102(4):417-24.

6Hazlehurst LA,Argilagos RF,Emmons M,etal.Cell adhesion to fibronectin(CAM-DR)influences acquired mitoxantrone resistance in U937 cells〔J〕.Cancer Res,2006;66(4):2338-45.

7Zhu B,Zhao L,Zhu L.Oroxylin A reverses CAM-DR of HepG2 cells by suppressing integrin β1 and its related pathway〔J〕.Toxicol App Pharmacol,2012;259(3):387-94.

〔2015-05-07修回〕

(编辑袁左鸣)

The establishment of three-dimensional cell culture model of A549 and the drug tolerance mechanism

CHE Ping,JI Xu-Ming,WU Zhi-Chun,etal.

Shandong University of Traditional Chinese Medicine,Jinan 250355,Shandong,China

【Abstract】ObjectiveTo establish a three-dimensional culture model (3D)of human lung cancer A549 cells,evaluate the tolerance of DDP to the 3D cells and study the cell adhesion mediated drug resistance(CAM-DR) mechanism.MethodsThe rat tail collagen solution was used to establish the 3D cell culture system,MTT method was used to detect the tolerance of 2D and 3D culture A549 cells to DDP,and discuss the CAM-DR mechanism.ResultsThe improved method 3D culture system of A549 cells was successfully established.The cells grew well and form some typical multicellular spheres.The IC50 value of DDP on 2D cells culture model was 12.84 μg/ml;the IC50 value of DDP on 3D cells culture model was 31.74 μg/ml,2.47 times of the 2D cells culture model.Comparing with that of blank control group,the cell inhibition ratio of the DDP treatment group and the MAB+DDP group were significantly higher(P<0.01),and the TSF+DDP group showed significant difference(P<0.05).Comparing with that of DDP treatment group,the cell inhibition ratio of the TSF+DDP group was obviously lower(P<0.05)and the MAB+DDP group significantly higher(P<0.05).ConclusionsThe 3D A549 cells culture model is established successfully using rat tail collagen solution.This model is more close to the tumor growing environment in vivo,and could reverse the adhesion-mediated drug resistance.The mechanism might be related with reducing the cells' adhesion mediated by the integrin β1.

【Key words】Three-dimensional cell culture;A549;DDP;Integrin β1;Adhesion-mediated drug resistance

通讯作者：欧阳兵(1963-)，男，教授，博士生导师，主要从事中医文献的临床和基础研究。

基金项目：国家自然科学基金资助项目(No.81273634)

〔中图分类号〕R733.6+2

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)03-0530-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.03.007