Triptolide 抑制角膜免疫反应及TGF-β诱导角膜基质细胞胶原收缩实验研究



*并列通讯作者

Triptolide 抑制角膜免疫反应及TGF-β诱导角膜基质细胞胶原收缩实验研究

高珣祎1,张文松2,张红1,王玲1*，周鸿雁1*

(1.吉林大学中日联谊医院 眼科，吉林 长春130033；2.吉林大学第二医院 眼科)

雷公藤内酯醇(Triptolide，TP)是中药雷公藤的一种成分，已证实具有多种药理作用如抗炎、免疫调节等[1]。感染性角膜炎是世界范围内，尤其是发展中国家的主要致盲性眼病之一。TNF-α作为Thl细胞分泌产生的炎性细胞因子之一，与IL-2、IFN-1等共同介导细胞免疫[2，3]，这些炎性因子及趋化因子可诱导炎性细胞对组织的浸润功能。可见，角膜感染时，控制角膜炎性细胞浸润及角膜炎症反应是治疗角膜炎的重要环节[4，5]。角膜基质中含有大量胶原蛋白，角膜胶原蛋白的正常代谢和结构对于维持角膜的通透性和形态有着关键作用。TGF-β可以促进多种细胞外基质的合成，促进Ⅰ 型胶原的转录、翻译等机制，促进局部成纤维细胞增殖活化，这些与角膜瘢痕形成密切相关[6]。角膜胶原能维持角膜的正常形状，如可抑制角膜胶原收缩量则可在角膜炎症晚期胶原重塑过程中抑制角膜瘢痕的形成。本实验我们通过测定每个皿中单个细胞释放的TNF-α量，以及胶原直径的量来探讨TP对角膜免疫反应和角膜炎症晚期瘢痕收缩的影响。

1材料和方法

1.1材料MEM,DPBS,胶原酶,蛋白酶，TP，TGF-β,Ⅰ型胶原。

1.2方法

1.2.1细胞采集新西兰大耳白兔(重2.0-2.5 KG)来自吉林大学实验动物中心，兔眼球摘除后用含抗生素DPBS水洗，机械方法去除角膜内皮及角膜上皮细胞，余下的角膜组织在37℃培养于含2 mg/mL dispase中1 h，并在collagenase(2 mg/mL,in MEM)37℃培养至获得单层贴壁角膜基质细胞，然后获得的角膜基质细胞用10% FBS 培养至第4-7代，用于实验研究。角膜基质细胞三维培养：角膜基质细胞用胰蛋白酶消化，15,000 转离心 5 min，用无血清培养液混悬，I型胶原，DMEM，0.26 M Na2CO3，0.2 M HEPES(pH 7.3)及角膜基质细胞混悬液在冰上按比例混合后放置于24孔板并在温箱中培养至凝固，然后加入TGF-β及相关浓度TP，然后再放置于温箱中培养不同时间。

1.2.2Triptolide对0.1 μg/ml LPS刺激U937巨噬细胞产生TNF-a的抑制作用实验 将10万U937巨噬细胞株培养于含10%FBS的RPMI1640中，经100Nm PMA 刺激培养48 h，使细胞贴壁，DPBS水洗，含10%FBS的RPMI1640换液，继续培养24 h，吸出培养液，设计4个实验组，分别是：单纯加入0.1 μg/ml LPS组，仅含培养液的单纯对照组，0.1 μg/ml LPS 联合0.03,0.3，3 μM TP组，分别加入培养皿，培养于含1%FBS的RPMI1640中1 h，进行细胞计数，ELISA方法检测每皿中单个细胞释放的TNF-a量。

1.2.3TP对TGF-β 诱导角膜基质胶原收缩实验的抑制作用实验：实验方法：兔角膜基质细胞培养于混合I型胶原的三维培养体系中，在培养体系中添加TGF-β1 μg/ml即可诱导角膜基质胶原收缩，胶原收缩的量由对胶原直径的测量获得。

2结果

2.1TP对0.1μg/mlLPS刺激U937巨噬细胞产生TNF-a的抑制作用实验结果如图1所示：TP可在浓度为0.3,3μM时抑制LPS刺激U937巨噬细胞产生的TNF-a量。

图1　　TP对0.1μg/mlLPS刺激U937巨噬细胞产生

2.2TP抑制TGF-β诱导的角膜基质胶原收缩图2示在添加TGF-β1μg/ml体系中，分别加入0.03,0.3,3μMTP，数据显示Tp可抑制TGF-β诱导的角膜基质胶原收缩量，并呈剂量依赖关系。

图2　　不同浓度的TP对培养体系角膜基质胶

2.3TP抑制TGF-β诱导的角膜基质胶原收缩图3显示，在TGF-β诱导的角膜基质胶原收缩模型中，在体系内添加及不添加3μMTP时，与对照组相比，添加组在第3天开始抑制胶原收缩量。

图3　　3μMTp可在第3天开始抑制培养体系角膜基质

3讨论

角膜炎是一种严重危害视力的眼科疾病。若诊疗不及时，可能导致角膜溃疡、穿孔、眼内炎，严重者需行眼球摘除。角膜基质主要由细胞外基质(主要为Ⅰ型胶原纤维)和角膜基质细胞(角膜成纤维细胞)组成。当角膜受到外界刺激时，角膜免疫细胞被激活可以产生一系列细胞因子和趋化因子，可介导角膜细胞增殖、坏死以及炎性细胞浸润角膜。角膜炎时角膜的主要病理特点是有大量的吞噬细胞浸润和明显的炎症反应。LPS可诱导U937巨噬细胞产生TNF-α，TNF-α通过影响NF-κB的活性来作用与角膜免疫细胞产生细胞炎症因子[7，8]。TGF-β可通过mTOR途径和MAPK途径诱导角膜肌纤维细胞形成[9，10]。

雷公藤是卫矛科一年生藤本植物，是我国一种传统中草药。TP是从雷公藤里提炼分离出的一种二萜内酯化合物，具有抗炎、免疫抑制、抗肿瘤等多种活性，TP有抑制炎症细胞因子的分泌，以及抑制角膜肌纤维细胞形成的功效[11]，可能会有降低角膜炎症反应和减轻角膜炎症晚期瘢痕形成的功能。

本研究结果显示LPS可以刺激U937巨噬细胞产生TNF-α，TP可以抑制U937巨噬细胞产生TNF-α的量，抑制的程度与加入TP的浓度呈正相关，表明TP可以作为对抗角膜炎症反应的新型药物。角膜基质胶原收缩模型中，在体系内添加及不添加3μMTP时，与对照组相比，添加组在第3天开始抑制胶原收缩量。在添加TGF-β1μg/ml的体系中，分别加入0.03,0.3,3μMTP，数据显示Tp可抑制TGF-β诱导的角膜基质胶原收缩量，并呈剂量依赖关系。这样的结果表明了TP对于抑制TGF-β介导的角膜胶原收缩有抑制作用，从而对于角膜炎症晚期的瘢痕形成应有一定的抑制作用。

TP可通过抑制U937巨噬细胞产生的TNF-α量从而抑制角膜炎症反应；TP对于TGF-β介导的角膜胶原收缩有抑制作用并呈剂量依赖关系，可以抑制角膜炎症晚期的角膜瘢痕收缩，TP是有潜力的治疗角膜炎症性疾病的制剂。

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(收稿日期：2015-11-25)

文章编号：1007-4287(2016)01-0019-03

基金项目：国家自然科学基金(81300727)资助；吉林大学白求恩B计划项目(吉林大学基本科研业务费2012230)