甲酸钠诱导视网膜光感受器细胞凋亡

胡　萍,王　英,金艳玲,杨海燕,许文晶,徐韶琳*

(1.吉林大学第二医院，吉林 长春130041；2.北京市延庆县医院，北京 延庆102100)



甲酸钠诱导视网膜光感受器细胞凋亡

胡萍1,王英1,金艳玲1,杨海燕2,许文晶1,徐韶琳1*

(1.吉林大学第二医院，吉林 长春130041；2.北京市延庆县医院，北京 延庆102100)

摘要：目的甲醇具有选择性神经毒性作用,世界各地因饮用假酒所致甲醇中毒事件时有发生,甚至有人因此而失明。我们将研究甲酸钠对视网膜光感受器细胞(661W细胞)的作用。方法将不同浓度的甲酸钠加入培养基的661W细胞中作用6-24 h，通过MTT法检测各组细胞相对存活率，然后，将661W细胞暴露于15 mM和30 mM浓度的甲酸钠中24 h，通过Hoechst 33342/PI染色法在荧光显微镜下观察细胞凋亡，用流式细胞仪检测细胞凋亡，用Western blotting法检测Bax，bcl-2，cleaved-caspase-3，cleaved-caspase-9的蛋白活性。结果MTT结果显示:甲酸钠可以诱导661w细胞浓度和时间依赖性生存率下降；细胞染色、流式细胞仪检测结果显示：甲酸钠可以诱导661W细胞发生凋亡；Western blotting结果显示:15 mM和30 mM的甲酸钠作用661W细胞24 h后，细胞Bax， cleaved-caspase-3，cleaved-caspase-9蛋白表达水平增加，而bcl-2蛋白表达水平降低。结论甲酸钠可以诱导光感受器细胞发生浓度和时间依赖性生存率下降，并且诱导661w细胞发生caspase依赖性细胞凋亡。

(ChinJLabDiagn,2016,20:0015)

甲醇具有选择性神经毒性作用,饮用假酒可以引起甲醇中毒，而甲醇中毒后常常导致较高的致盲率、致残率甚至致死率[1]。甲醇的代谢主要在肝脏内进行,通过连续的氧化反应后形成甲酸、甲醛和二氧化碳[2，3]。有研究提出，甲醇中毒后，视网膜发生的病理生理变化是由于甲酸盐诱导的线粒体功能障碍所致[4]。甲酸盐通过抑制细胞色素氧化酶的活性和电子传递链终端电子受体从而破坏线粒体的电子传递和能量产生[5]。甲酸盐抑制细胞色素氧化酶引起细胞ATP的大量消耗从而降低细胞能量水平并且导致细胞功能的破坏,甚至导致细胞死亡[6]。此外，有研究证实,视网膜和玻璃体中的甲酸盐浓度水平与血液中的甲酸盐浓度水平相一致[7]。

有研究报道浓度为5-30 mM的甲酸盐在体外和体内都可以抑制细胞色素氧化酶活性[8]。并且,在甲醇中毒的人类和猴子的血液、玻璃体、脑脊液中都可以检测到相似浓度的甲酸盐[9]。不同组织对甲醇中毒的敏感性不同，视网膜由于持续存在视觉功能和高代谢活动极易因视网膜ATP的消耗而受到影响，但是，由甲醇中毒所致的视网膜病变的具体病理生理机制尚未明确。

本研究检测甲酸钠对661W细胞的的作用，从而研究甲醇中毒所致的细胞死亡的分子机制。

1材料与方法

1.1抗体和反应物

多克隆抗体Bax、bcl-2购自美国Santa Cruz公司。cleaved-caspase-9，cleaved-caspase-3的抗体购自美国Cell Signaling Technology公司。GAPDH购自上海康晨生物技术公司。超敏ECL化学发光试剂盒(ECL-Plus Kit)购自上海碧云天公司。Annexin-V- FLUOS Staining Kit购自德国Roche Diagnostics公司。甲酸钠购自上海化学试剂国药控股有限公司。Hoechst33342，碘化丙啶(PI),MTT，购自美国sigma-aldrich公司。

1.2细胞培养

在含有10%的胎牛血清，100 u/ml的青霉素，100 g/ml的链霉素的培养液中培养661W细胞。将含有661W细胞的培养液置于37℃含有95%的空气和5%的CO2的饱和湿度的培养箱中。每3-4 d应用胰蛋白酶消化传代1次。

1.3661W细胞生存能力分析

661W细胞以5×103接种于96孔板，细胞培养24 h后，将不同浓度的甲酸钠(0,15,30,60和120 mM)加到培养基中。在对照组的培养基中加入等体积、等浓度的氯化钠。将平行细胞培养分别孵育6 h，12 h，和24 h。然后每孔加入5 g·L-1MTT20 μl，继续培养4 h,弃培养液，然后每孔加入150 μl的二甲亚矾(DMSO)，振动10 min。采用酶标仪检测蓝色甲在570 nm波长处的吸光度(A570)值。

1.4细胞染色检测细胞凋亡

用Hoechst33342和PI双染检测661W细胞的凋亡。将661W细胞加入15,30 mM浓度甲酸钠孵育24 h后，用10 μg/ml的Hoechst33342和PI染色30 min。用PBS液洗涤2次后，用荧光显微镜观察细胞形态并拍摄。

1.5流式细胞仪检测细胞凋亡

661w细胞常规培养24 h后，将661W细胞中加入15,30 mM浓度甲酸钠孵育24 h，细胞用不含EDTA胰酶消化、离心、PBS洗涤两次。然后将加入PBS(pH 7.4)缓冲液充分混匀，加入5 μl异硫氰酸荧光素(FITC)标记连接素(Annex in)和5 μl 20 mg/L普匹碘氨(PI)。混匀,避光室温孵育15 min,流式用细胞仪进行分析。

1.6Western blotting法检测661w细胞中各蛋白的表达水平

661w细胞常规培养24 h后，将661W细胞中加入15,30 mM浓度甲酸钠孵育24 h。收集细胞，离心，加入裂解液于冰上裂解30 min。细胞悬液在4℃,12 000 r/min离心10 min。在上清液中加入1/4容积的4×SDS样本液后煮沸5 min。 经SDS-PAGE电泳后，转膜至聚二氟乙烯膜上，用含有5%的脱脂牛奶室温封闭1 h。分别加入Bax、bcl-2、cleaved-caspase-3、cleaved-caspase-9和GAPDH一抗(1∶1 000)，于4℃过夜孵育。用TBST洗涤膜3次后，加入二抗(1∶2 000)，室温孵育30 min。充分洗涤后，用ECL液化学发光方法检测蛋白。

统计分析

应用SPSS17.0统计软件进行数据分析，差异的检测是通过对两组间的t检验，或多组间的方差分析得出的。有意义的基准设定为P<0.05和P<0.01。

2结果

2.1MTT法检测各组细胞生存率

661w细胞与120 mM浓度甲酸钠作用24 h后的细胞生存率与实验中其他浓度甲酸钠(15,30和60 mM)作用后的细胞生存率相比，前者明显下降。在与对照组进行比较中得出，将661w细胞分别加入15,30 mM浓度甲酸钠，作用24 h后的细胞生存率分别为78.5%与60.4%。因此，在接下来的试验中我们使用的是15,30 mM浓度的甲酸钠。MTT结果显示甲酸钠可以导致661w细胞活性的急性下降，与对照组相比有统计学差异(P<0.05)。如图1所示：甲酸钠可以以时间依赖性和剂量依赖性方式降低细胞生存率。

图1　MTT法检测各组细胞生存率， 随甲酸钠浓度增加，细胞生存率降低，并且甲酸钠与细胞作用时间增加，细胞生存率降低

2.2甲酸钠诱导661w细胞凋亡

用Hoechst33342和PI双染色检测甲酸钠对661w细胞凋亡的作用。如图2中所示：661w细胞与30 mM浓度的甲酸钠作用24 h后，可以导致Hoechst阳性细胞和PI阳性细胞增多。表明15,30 mM浓度的甲酸钠可以导致661w细胞凋亡。

图2　Hoechst33342和PI双染色检测甲酸钠对661w细胞凋亡的作用，661w细胞与15 mM，30 mM浓度的甲酸钠作用后，细胞凋亡率增加。A：对照；B：15 mM的甲酸钠；C：30 mM的甲酸钠

我们用Annexin V-FI TC/PI双标记流式细胞分析法检测661w细胞的凋亡率，将活细胞、早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞区分开。将661w细胞与不同浓度(15,30 mM)的甲酸钠作用24 h后，甲酸钠作用组与对照组未加入甲酸钠的661w细胞相比，前者出现大量的早期凋亡与晚期凋亡，早期凋亡百分比由2.88%增至18.43%,晚期凋亡由0.63%增至6.3%。15,30 mM浓度的甲酸钠组与正常对照组相比661w细胞早期凋亡率显著增加(P<0.01),总凋亡率亦显著增加(P<0.05,见图3)。结果显示，甲酸钠可以诱导661w细胞凋亡。

A：对照；B：15 mM的甲酸钠；C：30 mM的甲酸钠

2.3甲酸钠影响661w细胞内Bax与Bcl-2蛋白的表达

已证实Bcl-2蛋白家族在线粒体依赖性凋亡中有重要的作用，我们检测甲酸钠对抗凋亡蛋白Bcl-2和前凋亡蛋白Bax表达的影响。如图4示：将661 w细胞加入15,30 mM甲酸钠后，细胞内的Bcl-2水平明显下降而Bax水平增加，这表明暴露于甲酸钠中的661w的Bax/Bcl-2比值增加可能与线粒体依赖性凋亡途径相关。

2.4甲酸钠引起661w细胞内半胱天冬酶依赖性凋亡

凋亡是由两种细胞凋亡蛋白酶引起的，起始凋亡蛋白酶(caspases-2，-8，-9和-10)和效应凋亡蛋白酶(caspases-3，-6和-7)，起始凋亡蛋白酶分裂并激活效应凋亡蛋白酶中不活跃的部分，活化的效应凋亡蛋白酶分裂其他蛋白底物导致凋亡过程的发生[10]。如图5示,免疫印迹显示将细胞予甲酸钠处理后cleaved-caspase-3水平增加，此外，甲酸钠使细胞cleaved-caspase-9显著增加。这些数据表明在661w细胞内，甲酸钠可以诱导661w细胞凋亡，并且凋亡通路至少部分通过凋亡蛋白酶依赖性途径。

图4　Western blotting法检测Bax、bcl-2蛋白水平

图5　Western blotting法检测cleaved-caspase-3、cleaved-caspase-9蛋白水平

3讨论

甲醇是引起急性酒精中毒的一个重要原因。急性酒精中毒的病人会有神经系统、视觉、胃肠道的相应症状。视力障碍一般表现为轻微畏光，视力模糊，视敏度明显下降甚至失明。即使患者进行有效的治疗，甲醇中毒仍有较高的死亡率[1，11]。

有研究报道,甲醇中毒后,视网膜ATP合酶减少。蛋白质学组分析大鼠视网膜发现甲酸钠可以引起光感受器细胞内的ATP明显减少[6，12]。本研究中我们发现661w细胞中加入甲酸钠可以使细胞活力急性下降。

细胞内的Bax/Bcl-2比值可以调节细胞凋亡[13]。本研究发现，经过15,30 mM浓度的甲酸钠处理过的661w细胞内的Bcl-2蛋白的表达水平显著降低而Bax的水平增加。此外，经甲酸钠处理后，661w细胞内cleaved-caspase-3与cleaved-caspase-9的水平明显增加。这些结果表明，Bax/Bcl-2比值与cleaved-caspase的增加可能与甲酸钠诱导的线粒体依赖性凋亡途径相关。

细胞遭受到轻微的刺激可以通过选择性去除损伤的线粒体和促进凋亡的线粒体来达到保护作用。然而，重大的刺激可以导致大量的线粒体损伤，这超过了细胞的自救能力，使细胞ATP的产生大量减少，并释放细胞色素C，最终导致光感受细胞的凋亡。因此，甲酸钠引起661w细胞线粒体功能障碍甚至细胞凋亡的发生。

很多研究认为，多种视网膜疾病的发病机制存在着视网膜能量代谢障碍和氧化应激能力的下降，如年龄相关性黄斑变性和糖尿病性视网膜病变等，甲酸钠诱导661w细胞的功能障碍的研究可能会为其他获得性或者遗传性视网膜疾病的发病机制的研究提供有价值的依据。

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关键词：甲醇中毒；甲酸钠；凋亡；661W细胞

Sodium formate induces photoreceptor cells apoptosisHUPing,WANGYing,JINYan-ling,etal.(TheSecondHospitalofJilinUniversity,Changchun130041,China)

Abstract:ObjectiveMethanol intoxicated accidents caused by drinking fake wine take place now and then in the world.Some people become blindness due to methanol selective neurotoxicity.This study was to investigate the effects of sodium formate exposure on photoreceptor cells (661W cells).Methods661W cells were exposed to dfferent concentrations of sodium formate for 6-24 h.The cell viability was determined by 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) assays.Then,661W cells were exposed to 15mM and 30 mM sodium formate for 24 h.Apoptosis was determined by Hoechst 33342/propidium iodide (PI) staining,visualized under a fluorescence microscope,and annexin V-FITC staining using flow cytometry.The activation of Bax,Bcl-2,cleaved-caspase-3 and cleaved-caspase-9,was evaluated by western blotting.ResultsMTT assay showed that,sodium formate treatment induced a decrease in 661W cell viability in a time- and dose-dependent manner；DCFH-DA staining and flow cytometry showed that ,sdium formate induces 661W cells apoptosis.Western blotting showed that,661W cells exposed to sodium formate for 24 h increased levels of Bax,cleaved-caspase-3 and cleaved-caspase-9,but decreased levels of Bcl-2.ConclusionThese results suggest that sodium formate treatment reduced the cell viability in a time- and dose-dependent manner and triggers caspase-dependent apoptosis of 661W cells.

Key words:methanol intoxication;sodium formate;apoptosis;661W cells

(收稿日期：2015-03-20)

作者简介：胡萍(1990-),女，在读医学硕士，主要从事青光眼及视神经疾病方面的研究。

文献标识码：A

中图分类号：R774.1

文章编号：1007-4287(2016)01-0015-05

*通讯作者