IGF信号通路与肺腺癌EGFR-TKI治疗获得性耐药的关系

王永涛　李波清

作者单位:255400 滨州医学院附属临淄区人民医院(王永涛)；264003 滨州医学院基础医学院病原生物学教研室(李波清)

IGF信号通路与肺腺癌EGFR-TKI治疗获得性耐药的关系

王永涛李波清

作者单位:255400 滨州医学院附属临淄区人民医院(王永涛)；264003 滨州医学院基础医学院病原生物学教研室(李波清)

【摘要】目的探究胰岛素样生长因子信号通路在肺腺癌EGFR-TKI治疗获得性耐药中的作用。方法采用免疫组织化学SP法检测64例肺腺癌组织和16例正常肺组织中IGF1R和EGFR的表达，ELISA法检测晚期肺腺癌患者血清中IGF1的含量。结果IGF1R在肺腺癌组织中的表达与对照组无显著差异，IGF1R的表达与患者各临床病理参数无显著相关性(P>0.05)。EGFR在肺腺癌组织中的表达显著高于对照组，且EGFR的表达受肿瘤分化程度、浸润深度、淋巴结转移及分期的影响(P<0.05)。IGF1R与EGFR在肺腺癌患者中的表达显著相关(P<0.05)；在晚期接受EGFR-TKI治疗的肺腺癌患者中，病情进展后血清中IGF1的含量较治疗前显著增高(P<0.05)。结论胰岛素样生长因子信号通路在肺腺癌患者EGFR-TKI治疗获得性耐药中起一定作用。

【关键词】肺腺癌；IGF1R；EGFR；IGF1；EGFR-TKI；耐药

(ThePracticalJournalofCancer,2016,31:029～032)

肺癌是包括中国及美国在内的世界许多国家癌症的头号死亡原因。2014年美国肺癌的新发病例数估计为224210例，死于肺癌的患者估计将达159260例[1]。尽管在过去的10年中，在肺癌的筛查、微创性诊断及治疗以及靶向治疗等领域的研究取得了重要的进展，但目前仅有16.6%的患者能够在确诊后存活5年及以上[2]。由于肿瘤细胞的异质性及基因组的不稳定性，靶向治疗的患者仍不可避免的出现耐药。因此，通过对细胞信号转导通路的研究将有助于我们进一步明确靶向治疗耐药机制，为联合多靶点抗肿瘤药物及逆转耐药提供理论依据。本研究首先检测EGFR与IGF1R在肺腺癌患者中的表达情况，进一步分析二者表达的相关性并探讨可能的分子机制；然后研究晚期肺腺癌患者口服EGFR-TKI治疗前与口服EGFR-TKI病情进展后血液中IGF1含量的变化，进一步分析IGF1R信号转导通路在国人EGFR-TKI治疗获得性耐药中的作用，为靶向EGFR与联合IGF1R治疗肺腺癌患者提供一定的理论依据。

1材料与方法

1.1　研究对象

按照患者术前检查资料完善、手术记录及术后病理资料完整、术后病理证实为肺腺癌及术前未行新辅助放化疗的入组标准，除外既往患有其他恶性肿瘤的患者、肺良性肿瘤及糖尿病等代谢性疾病的患者。最终本研究首先收集淄博市临淄区人民医院2002年10月1日至2010年12月31日之间行手术治疗的64例肺腺癌患者的肺癌组织及16例正常肺组织。64例患者中男性28例，平均年龄57岁；女性36例，平均年龄59岁；按肿瘤分化程度：高分化11例，中分化19例，低分化34例；按照AJCC第六版肺癌TNM分期：T122例，T232例，T310例；N022例，N135例，N27例；Ⅰ期16例，Ⅱ期38例，Ⅲ期10例。之后收集淄博市临淄区人民医院肿瘤血液科2012年5月1日至2014年8月31日之间收治的晚期肺腺癌患者共20例，患者满足病理证实为肺腺癌且存在EGFR突变、体力状态评分(performance status，PS)0～2分及按实体肿瘤疗效评价标准(RECIST 1.0版)具有至少1个可测量的病灶用于后续疗效评定的入选标准。

1.2　实验试剂

IGF-1ELISA试剂盒及免疫组化所需兔抗人IGF1R和EGFR单克隆抗体、山羊抗兔IgG/HRP多聚体及DAB试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司，其他试剂由淄博市临淄区人民医院病理科提供。

1.3　实验方法

1.3.1免疫组化本研究采用免疫组织化学SP法，蜡块切成厚约4 μm放入60 ℃烘箱内烤片过夜；脱蜡；抗原微波热修复；内源性过氧化物酶灭活；滴加山羊血清封闭液；滴加兔抗人IGF1R或兔抗人EGFR单克隆抗体工作液，37 ℃孵育2 h；滴加山羊抗兔IgG/HRP多聚体，温育30 min；滴加DAB显色剂；苏木精复染，中性树胶封片。

1.3.2ELISA实验于应用EGFR-TKI治疗前及EGFR-TKI治疗进展后取入组患者静脉血，清晨空腹采集静脉血5 mL，离心后取血清于-20 ℃保存，之后按ELISA试剂盒说明检测患者血清中IGF-1含量。所有患者均签署知情同意书。

1.4　结果判定

IGF1R和EGFR阳性染色为细胞胞膜及胞质着色呈黄色或棕黄色颗粒。应用Mattern积分法，即由染色阳性细胞的百分比和染色强度进行评估。每例标本选择含有阳性细胞的5个高倍镜视野(×400)，并计数100个肿瘤细胞，最后取其平均值作为阳性细胞百分率，0：阳性细胞=0%，1：阳性细胞≤10%，2：阳性细胞≤50%，3：阳性细胞>50%。染色强度评估，0：阴性，1：浅黄色，2：深黄色，3：棕黄。最终将上述两值相加，积分≤1视为阴性表达结果，积分2～6判定为免疫组化阳性表达结果，并进一步将2～3分判定为弱阳性，4～6分为强阳性。

以上均由病理科2名医师采用单盲法进行阅片。

1.5　统计方法

应用SPSS 13.0统计学软件进行统计分析，IGF1R和EGFR受体与各临床病理参数之间采用χ2检验；两变量相关性采用Spearman等级相关进行分析，肺腺癌患者应用EGFR-TKI治疗前及疾病进展后血清中IGF1的变化应用配对t检验。以上均以P<0.05作为差异有统计学意义的标准。

2结果

2.1　癌组织与癌旁组织中IGF1R及EGFR的表达情况

IGF1R及EGFR阳性表达主要位于肺癌细胞胞质中。如表1所示，在肺腺癌患者中，IGF1R强阳性表达率为51.56%(33/64)，正常肺组织中的强阳性表达率为43.75%(7/16)，二者无统计学差异(P>0.05)；肺腺癌组织EGFR的强阳性表达率为40.63%(26/64)，而在正常肺组织中强阳性表达率为0.00%(0/16)，二者间差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2　肺腺癌组织中IGF1R和EGFR的表达与临床病理参数间的关系

如表1所示，IGF1R在肺腺癌患者癌组织中的表达与患者各临床病理参数无显著相关性(P>0.05)；而EGFR的表达受肿瘤分化程度、浸润深度、淋巴结转移及分期的影响(P<0.05)。

2.3　肺腺癌组织中IGF1R与EGFR表达之间的关系

64例肺腺癌患者中，IGF1R与EGFR的表达同为阳性者为22例，同为阴性者为27例，二者的表达呈显著相关性(γ=0.547，P<0.05)。见表2。

表2　IGF1R与EGFR在肺腺癌中表达的相关性分析/例

2.4　EGFR-TKI治疗前及EGFR-TKI治疗进展后患者血清中IGF1含量的变化

入组的晚期肺腺癌EGFR突变患者接受EGFR-TKI治疗前IGF1血清含量为(152.375±11.426)μg/l，EGFR-TKI治疗进展后为(192.125±14.952)μg/l，应用配对t检验，EGFR-TKI治疗耐药前后IGF1血清含量显著升高(t=7.342,P<0.05)。

表1　IGF1R、EGFR的表达与肺腺癌临床病理特征间的关系/例

3　讨论

EGFR-TKI耐药主要有两种情况：一是原发性耐药；二是获得性耐药。目前原发性耐药的准确分子机制尚不清楚，一些学者认为不同患者间EGFR基因突变位点存在差异，因而造成了患者对酪氨酸激酶抑制剂的敏感性不同。例如，典型的EGFR突变为19外显子L858R点突变，该突变类型的患者对TKI治疗高度敏感[3]，然而EGFR基因20外显子插入突变的患者对EGFR-TKI的治疗无效[4]。而对于获得性耐药的研究主要有两种机制，一种为EGFR基因的二次突变使得下游通路再次激活[5]，另一种情况为下游信号分子通过不同通路间交叉对话而激活[6]，目前了解较多的是肝细胞样生长因子(c-MET)受体的扩增，进而激活下游PI3K-AKT信号分子造成耐药[7]。

胰岛素受体及胰岛素样生长因子受体是受体酪氨酸激酶(RTK)家族的一员。胰岛素样生长因子1受体(IGF1R)及胰岛素受体在人体正常组织中存在广泛表达，这些受体均为四聚体结构，其中胞外结构域与配体结合，胞内结构域含有酪氨酸激酶结构域[8]。IGF1R的激活可进一步引起下游通路中PI3K、AKT、RAS等的活化[9]，影响细胞的代谢、促进细胞的存活。目前已有实验证实IGF1R在肿瘤细胞系及肿瘤组织中广泛表达，并且IGF对肿瘤细胞系具有促有丝分裂作用[10]。

我们应用免疫组化法检测了64例肺腺癌患者和16例正常对照组之间IGF1R的表达情况，发现IGF1R在肺腺癌中的强阳性表达率为51.56%，而在正常肺组织中的表达也达到43.75%，二者间无显著差异(P>0.05)。本研究的结果与Cappuzzo等[11]的研究结果相似，Cappuzzo检测了369例非小细胞肺癌患者，最后证实IGF1R在非小细胞肺癌患者中的表达率为76.4%。本研究进一步的分析显示IGF1R在肺腺癌患者不同性别、年龄、分化程度、浸润深度、淋巴结转移及分期的表达无显著差异(P>0.05)，这一结果与Gately等[12]的结果相一致，Gately的实验证实在非小细胞肺癌患者中IGF1R的表达与性别、年龄、是否吸烟、浸润深度、淋巴结转移及分期无关。

EGFR属于受体酪氨酸激酶(RTK)中的HER/erbB家族，该家族成员包括HER1(EGFR/erbB1)、HER2(neu/erbB2)、HER3(erbB3)及HER4(erbB4)[13]。EGFR通过胞外结构域与配体结合，通过跨膜细胞信号转导，进而激活RAS-RAF-MEK-MAPK、PI3K-AKT等胞内信号转导通路[14]。EGFR下游信号通路在肿瘤细胞抗凋亡、促存活、迁移及血管生成过程中发挥重要作用[15]。目前研究显示，EGFR胞内酪氨酸激酶结构域的活性可受EGFR基因突变、EGFR基因拷贝数增加及EGFR过表达等多种方式而异常活化[16]。本研究发现EGFR在肺腺癌中的强阳性表达率为40.63%(26/64)，显著高于正常肺组织(P<0.05)。进一步分析显示，EGFR在肺腺癌中的表达受不同分化程度、浸润深度、淋巴结转移及分期的影响(P<0.05)。

目前，已有基础实验证实IGF1R作为RTK家族的一员，同EGFR通路间存在广泛的交叉对话，并共同激活下游PI3K/AKT及MAPK信号通路[17]。Gong等[18]的实验证实了联合IGF1R及EGFR靶向药物可以引起非小细胞肺癌细胞系的凋亡，而单一靶点的抑制仅引起细胞周期停滞。本研究发现在应用EGFR-TKI治疗进展后，患者血清中IGF1的含量明显增高，对此可能的解释是：血清中增高的IGF1激活IGF1R信号转导通路，该通路因与EGFR信号通路间存在交叉对话进而激活共同的下游PI3K/AKT及MAPK信号通路，从而造成耐药。因此，联合IGF1R及EGFR靶向药物可能在逆转EGFR-TKI获得性耐药中产生较好的临床疗效，最终使患者受益。

参考文献

[1]Siegel R,Ma J,Zou Z,et al.Cancer statistics,2014 〔J〕.CA Cancer J Clin,2014,64(1):9-29.

[2]Forde PM,Ettinger DS.Targeted therapy for non-small-cell lung cancer:past,present and future〔J〕.Expert Rev Anticancer Ther,2013,13(6):745-758.

[3]Pao W,Chmielecki J.Rational,biologically based treatment of EGFR-mutant non-small-cell lung cancer〔J〕.Nat Rev Cancer,2010,10(11):760-774.

[4]Yasuda H,Kobayashi S,Costa DB.EGFR exon 20 insertion mutations in non-small-cell lung cancer:Preclinical data and clinical implications〔J〕.Lancet Oncol,2012,13(1):e23-e31.

[5]Sierra JR,Cepero V,Giordano S.Molecular mechanisms of acquired resistance to tyrosine kinase targeted therapy〔J〕.Mol Cancer,2010,9:75.

[6]Ellis LM,Hicklin DJ.Resistance to targeted therapies:Refining anticancer therapy in the era of molecular oncology〔J〕.Clin Cancer Res,2009,15(24):7471-7478.

[7]Engelman JA,Zejnullahu K,Mitsudomi T,et al.MET amplification leads to gefitinib resistance in lung cancer by activating ERBB3 signaling〔J〕.Science,2007,316(5827):1039-1043.

[8]De Meyts P.Insulin and its receptor:structure,function and evolution〔J〕.Bioessays,2004,26(12):1351-1362.

[9]Frasca F,Pandini G,Sciacca L,et al.The role of insulin receptors and IGF-I receptors in cancer and other diseases〔J〕.Arch Physiol Biochem,2008,114(1):23-37.

[10]Pollak MN,Schernhammer ES,Hankinson SE.Insulin-like growth factors and neoplasia〔J〕.Nature Rev Cancer,2004,4(7):505-518.

[11]Cappuzzo F,Tallini G,Finocchiaro G,et al.Insulin-like gr-

owth factor receptor 1 (IGF1R) expression and survival in surgically resected non-small-cell lung cancer(NSCLC) patients〔J〕.Ann Oncol,2010,21(3):562-567.

[12]Gately K,Forde L,Cuffe S.High coexpression of both EGFR and IGF1R correlates with poor patient prognosis in resected non-small-cell lung cancer〔J〕.Clin Lung Cancer,2014,15(1):58-66.

[13]Yarden Y,Sliwkowski MX.Untangling the ErbB signaling -

network〔J〕.Nat Rev Mol Cell Biol,2001,2(2):127-137.

[14]Jimeno A,Hidalgo M.Pharmacogenomics of epidermal gro-

wth factor receptor (EGFR) tyrosine kinase inhibitors〔J〕.Biochim Biophys Acta,2006,1766(2):217-229.

[15]Mosesson Y,Yarden Y.Oncogenic growth factor receptors:implications for signal transduction therapy〔J〕.Semin Cancer Biol,2004,14(4):262-270.

[16]Ciardiello F,Tortora G.EGFR antagonists in cancer treatment 〔J〕.N Engl J Med,2008,358(11):1160-1174.

[17]Belani CP,Goss G,Blumenschein G.Recent clinical developments and rationale for combining targeted agents in non-small cell lung cancer (NSCLC)〔J〕.Cancer Treat Rev,2012,38(3):173-184.

[18]Gong Y,Yao E,Shen R,et al.High expression levels of total IGF-1R and sensitivity of NSCLC cells in vitro to an antiIGF-1R antibody (R1507)〔J〕.PLoS One,2009,4(10):e7273.

(编辑：吴小红)

Relationship between Insulin-Like Growth Factor Signaling Pathway and Drug Resistance of EGFR-TKI Therapy in Lung Adenocarcinoma

WANGYongtao,LIBoqing.LinziDistrictPeople'sHospitalAffiliatedtoBinzhouMedicalCollege,Zibo,255400

【Abstract】ObjectiveTo explore the relationship between insulin-like growth factor(IGF) signaling pathway drug resistance of EGFR-TKI therapy in lung adenocarcinoma.MethodsThe expression of IGF1R and EGFR were detected by streptavidin perotridase in 64 cases of lung adenocarcinoma tissues and 16 cases of normal lung tissues.The content of IGF1 in serum of patients with advanced lung adenocarcinoma were detected by ELISA.ResultsThere were no significant differences in IGF1R expression between the 2 groups and the expression of IGF1R also had no significant correlation with clinicopathologic parameters(P>0.05).The expression of EGFR in the lung adenocarcinoma was significantly higher than that of the control group and was associated with degrees of differentiation,depth of invasion,lymph nodes metastasis and stages (P<0.05).The expression of IGF1R in patients with lung adenocarcinoma was significantly associated with EGFR (P<0.05).The serum level of IGF1 in patients with advanced lung adenocarcinoma significantly increased after resistance to EGFR-TKI therapy (P<0.05).Conclusion

IGF signaling pathway plays a certain role in acquired resistance to EGFR-targeted therapy in lung adenocarcinoma.

【Key words】Lung adenocarcinoma;IGF1R;EGFR;IGF1;EGFR-TKI;Resistance

中图分类号：R734.2

文献标识码：A

文章编号：1001-5930(2016)01-0029-04

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2016.01.009

通讯作者：李波清

收稿日期(2015-04-21修回日期 2015-09-29)