基于IGS和Histone 基因的我国芒果镰孢菌遗传多样性分析

吴丹妮, 赵志慧, 王艳红, 周 扬, 姚毅恒, 陆 俊， 吕国忠

(大连民族大学环境与资源学院, 辽宁大连 116600)



基于IGS和Histone 基因的我国芒果镰孢菌遗传多样性分析

吴丹妮, 赵志慧*, 王艳红, 周 扬, 姚毅恒, 陆 俊， 吕国忠

(大连民族大学环境与资源学院, 辽宁大连 116600)

摘要[目的]研究我国芒果镰孢菌的遗传多样性。[方法]从云南、广西、海南等芒果主产区芒果花序上分离得到芒果镰孢菌，采用IGS、Histone 2个基因片段对芒果镰孢菌进行遗传多样性分析。[结果]我国芒果镰孢菌具有多个谱系，致病芒果镰孢菌为单系群。[结论] 我国芒果镰孢菌具有较高的遗传多样性。

关键词芒果；花序畸形病；芒果镰孢菌

Genetic Diversity ofFusariummangiferaein China Inferred from IGS and Histone

WU Dan-ni, ZHAO Zhi-hui*,WANG Yan-hong et al (College of Environmental and Resource Science, Dalian Nationalities University, Dalian, Liaoning 116600)

Abstract[Objective] To study genetic diversity ofFusariummangiferaein China. [Method] Genetic diversity amongF.mangiferaefrom Hainan, Guangxi and Yunnan provinces using the partial IGS and Histone gene sequences were analyzed. The strains were isolated from symptomatic and non-symptomatic inflorescences and twigs. [Result]It was indicated that high genetic variation existed among those strains in China, while the pathogenetic isolates were monophyletic. [Conclusion]Fusariummangiferaein China has high genetic diversity.

Key wordMango; Mango malformation;Fusariummangiferae

芒果花序畸形病(Mango malformation disease, MMD)已成为目前芒果生产上的主要病害之一[1]，在世界上主要芒果产区如菲律宾、马来西亚、南美的墨西哥等一些国家均有发生[2-3]，并不断蔓延。一旦发生芒果花序畸形病，芒果树不能正常开花结果，造成巨大的经济损失。

Watt等[4]于1891年首次发现芒果花序畸形病，通过柯赫氏法则证明该病是由镰孢菌FusariummoniliformeSheldon var.subglutinansWollenweber & Reinking引起的[5]，根据形态学和分子系统学研究结果将该病原菌正式定名为芒果镰孢菌F.mangiferaeBritz, Wingfield et Marasas[6]。到目前为止，已报道引起芒果花序畸形病的病原镰孢菌除芒果镰孢菌外，还有3种：F.mexicanumT. Aoki, S. Freeman, Otero-Colina, Rodríguez-Alvarado, Fernández-Pavía, Ploetz et O’Donnell，F.sterilihyphosumBritz, Marasas & Wingfield，F.pseudocircinatumO'Donnell & Nirenberg[7-8]。2008 年8 月在四川攀枝花和云南华坪首次发现了芒果畸形病[1]，经鉴定该病原菌为F.mangiferaeBritz, Wingfield et Marasas[9]。该病主要发生在我国金沙江干热河谷地区且日趋严重，发病率可达30%～60%，有的甚至高达95%[10]。笔者对广西、海南、云南等地芒果花序上的芒果镰孢菌进行研究，采用IGS和Histone 2个基因片段分析芒果镰孢菌的遗传多样性，从而研究芒果镰孢菌在我国的发生分布情况。

1材料与方法

1.1材料供试30株镰孢菌来自广东省、海南省、广西壮族自治区3省区开花期芒果花序(表1)。采用组织分离法在PDA培养基上分离培养菌株，采用单孢分离法获得纯培养，在SNA培养基上培养保存，保藏于大连民族大学真菌资源与利用实验室。

表1　供试菌株及来源

1.2DNA提取及PCR扩增DNA提取方法参照Lee等[11]方法。IGS区采用扩增引物NL11、CNS1及中间引物NLa、CNSa进行PCR扩增并测序[12]，退火温度58 ℃。Histone片段采用引物H3-1a和H3-1-b进行PCR扩增并测序[13]。PCR产物送上海生工生物工程有限公司测序。测序结果在NCBI中比对，并构建系统发育树。

1.3系统发育分析用软件ClustalX进行比对，手动调整。采用软件MEGA6.0，以F.saccahari(NRRL13999)为外群，分别构建基于IGS和Histone的最小进化树，Bootstrap 1000 replicates； seed=64238。

2结果与分析

2.1Histone基因片段分析采用引物H3-1a和H3-1b对来自芒果花序的30株镰孢菌Histone H3区DNA进行PCR扩增，得到约447 bp的基因片段。以甘蔗镰孢菌F.sacchari菌株NRRL13999为外群，采用MEGA 6.0构建最小进化树(图1)，对芒果花序畸形病菌进行分析。F.mangiferae形成3个谱系：I、II、III。谱系I包括菌株19、18、34、15、33、30、14、29、32、16、23、17、5(bootstrap=63%)；菌系II包括菌株1、9、10、11、12、8、6、7(bootstrap=66%)；菌系II包括3、4、13(bootstrap=96%)。在F.mangiferae中，菌系II的菌株均来自云南省华坪地区，菌系I的菌株则主要来自海南地区，菌系III中的3、4号菌株来自广西百色，而13号菌株则来自海南三亚。

图1　基于Histone H3基因片段构建芒果镰孢菌的最小进化树Fig. 1　 Minimum evolution tree of Fusarium mangiferae in China inferred from Histone H3 sequences data

2.2IGS片段分析采用镰孢菌基因内间隔区IGS引物NL11和CNS1[12]，对来自我国芒果花序的30株镰孢菌进行PCR扩增，得到约2 200 bp的基因片段。以甘蔗镰孢菌F.sacchari菌株NRRL13999为外群，采用MEGA 6.0构建最小进化树(图2)。基于IGS区构建的最小进化树与Histone H3构建的最小进化树基本一致，结合Histone H3基因片段的最小进化树，将全部F.mangiferae分为3个谱系：I、II、III。IGS片段最小进化树中，谱系II依然形成一个单系群(bootstrap=100%)，而与来自广西、海南的菌株分开(bootstrap =51%)。菌系I发生非常丰富的多样性分化，其中包括来自海南和广西的菌株。菌系III出现分化，13号菌株与菌系I亲缘关系更近。

图2　基于IGS基因片段构建我国芒果镰孢菌的最小进化树Fig. 2　Minimum evolution tree of Fusarium mangiferae in China inferred from IGS sequences data

3结论与讨论

目前已报道的病原镰孢菌有4种：F.mangiferae，F.mexicanum，F.sterilihyphosum以及F.pseudocircinatum[6-8,10]。我国发生的芒果花序畸形病主要由F.mangiferae引起[9]。镰孢菌Histone H3是一个相对更为保守的区域，种内分歧较小，而IGS区域种内分歧较大，适于种内群体的研究。采用IGS和Histone H3 2种基因片段对采自云南、广西、海南的芒果花序上分离的镰孢菌进行遗传多样性分析。基于2个基因片段分别构建我国芒果镰孢菌的最小进化树，基于Histone H3的最小进化树上所有芒果镰孢菌形成3个谱系，而IGS最小进化树上芒果镰孢菌的种内分化明显，形成更丰富的多样性，表明在芒果镰孢菌中Histone H3基因片段较IGS更为保守。为了便于分析，以Histone H3的最小进化树为标准，将所有芒果镰孢菌分为3个谱系：I、II、III。所有来自我国芒果花序畸形病重灾区云南省华坪县的菌株均在谱系II中，无论在Histone H3还是IGS系统分析中均未发生遗传分化，说明来自华坪的致病性芒果镰孢菌遗传信息较为单一，可能是单一来源的，即发生在华坪县的芒果花序畸形病可能是从一个地区一批次传播到该地区的。谱系I在我国海南地区普遍存在，且遗传分化明显，具有丰富的遗传多样性。谱系III菌株主要来自广西和海南，但用于研究的菌株较少，未见明显的遗传分化和多样性。谱系I和谱系III菌株主要分布在广西和海南，但未见明显的芒果花序畸形病的症状。

该研究发现我国芒果镰孢菌遗传多样性非常丰富，分化程度极高，这可能与芒果的东南亚起源以及在我国具有悠久的种植历史有关，芒果镰孢菌在与芒果的长期共存中发生遗传分化。

参考文献

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收稿日期2015-12-04

作者简介吴丹妮(1994- )，女，黑龙江虎林人，本科生，专业：生物技术。 *通讯作者，讲师，博士，从事真菌分类学研究。

基金项目中央高校基本科研业务费专项基金项目(DC201502070301); 大学生创新创业训练计划项目(S2014055)。

中图分类号S 188+.1

文献标识码A

文章编号0517-6611(2016)01-234-02