基因芯片法检测体检人群ALDH2基因多态性＊

徐筱婧，瞿　浩，张　华△

(贵州省人民医院：1.检验科；神经内科，贵州贵阳 550002)



·论著·

基因芯片法检测体检人群ALDH2基因多态性＊

徐筱婧1，瞿浩2，张华1△

(贵州省人民医院：1.检验科；神经内科，贵州贵阳 550002)

摘要:目的采用基因芯片法检测体检人群ALDH2基因，评价该方法应用于临床检测的可行性。方法检测对象为100例体检人员，采用基因芯片检测法，检测ALDH2基因第487突变位点3个不同的基因分型：GG型、GA型、AA型。结果共检出GG型72例，GA型26例，AA型2例。结论基因芯片检测法可满足临床ALDH2基因检测的要求，具有较好的临床应用前景。

关键词:ALDH2基因；芯片检测

人乙醛脱氢酶2(aldehyde dehydrogenase，ALDH2)是一种位于12号染色体编码基因呈高度多态性的四联体蛋白，为酒精代谢的关键酶[1]，芯片检测法是近年来兴起的一项基因检测技术，为探讨该方法临床应用可行性，笔者对100例体检样本进行了检测，现报道如下。

1资料与方法

1.1一般资料2010年11月至2011年9月期间本院体检人员，共100例。其中男79例，女21例，年龄20～66岁，平均(42.29±7.52)岁,遵循受检者知情自愿原则。

1.2仪器与试剂上海百傲公司杂交仪、扫描仪；上海百傲科技公司ALDH2基因检测试剂盒、ALDH2基因检测芯片判别系统；天根生化科技有限公司全血基因组DNA提取试剂盒；北京博奥科技公司DNA定量仪、普通PCR扩增仪。

1.3方法

1.3.1标本采集与处理采集外周静脉血2 mL(EDTA抗凝)，用上海百傲科技有限公司血液基因组DNA提取系统(离心柱型)试剂盒，提取全血DNA。

1.3.2基因组DNA电泳分析2%琼脂糖凝胶，6×Loading buffer 1 μL与5 μL DNA样本混匀后点样，5 μL Marker点样，100 V电泳30 min，凝胶成像系统读取结果见图2。

1.3.3PCR反应按试剂盒说明书准备反应体系，见表1。PCR反应程序为：50 ℃ 5 min；94 ℃ 5 min；94 ℃ 25 s，60 ℃ 25 s，72 ℃ 30 s，35 cycles;72 ℃ 5 min。

1.3.4PCR产物电泳分析2%琼脂糖凝胶，6×Loading buffer 1 μL与5 μL PCR扩增产物混匀后点样，5 μL Marker点样，100 V电泳30 min，凝胶成像系统读取结果见图3。

表1　　PCR扩增反应体系

1.3.5杂交按上海百傲基因检测试剂盒说明书配备杂交体系进行杂交，杂交程序设置见表2，杂交总时间约为1 h 40 min。

1.3.6芯片扫描及判读杂交完毕，用上海百傲基因芯片扫描仪进行扫描，ALDH2判读系统进行基因型判读。芯片点阵见图1(见《国际检验医学杂志》网站“论文附件”)。

1.4统计学处理采用Excel统计软件进行数据处理。

2结果

2.1基因组DNA电泳结果如图2所示:提取的基因组DNA位于点样孔附近，条带完整、清晰、明亮，DNA质量好，1～5泳道均为样本基因组DNA，见图2(见《国际检验医学杂志》网站“论文附件”)。

2.2PCR电泳结果ALDH2基因片段大小为438 bp，目标片段在250～500 bp之间，与目的片段大小吻合。1～5泳道均为PCR扩增产物。见图3(见《国际检验医学杂志》网站“论文附件”)。

表2　　杂交程序

2.3100例样本各基因型比例100例检测样本中，共检测出野生纯合型(GG型)72例；杂合突变型(GA型)26例；突变纯合型(AA型)2例。100例样本中各基因型所占比例分布见表3。

表3　　100例体检样本各基因型比例

2.4ALDH2基因芯片检测结果为验证芯片结果的准确性，取部分样本进行测序，ALDH2各基因型芯片扫描图及对应测序图，芯片检测结果与测序结果吻合见图4～6(见《国际检验医学杂志》网站“论文附件”)。

3讨论

人类ALDH2基因上共发现了84个单核苷酸多态性位点，其中在外显子12处发生点突变(Glu487Lys)，谷氨酸Glu(密码子GAA)变为赖氨酸Lys(密码子AAA)，使正常的等位基因G，变为突变型等位基因A，导致该基因编码的酶的催化能力下降[2]。因遗传，在人群中该酶基因型出现3种情况，具有正常催化活性的纯合子型：GG型；催化活性下降的杂合子型：GA型；催化活性失去的纯合子型：AA型。乙醛脱氢酶是酒精代谢的关键酶。在肝脏内，乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase，ADH)催化乙醇脱氢生成乙醛，乙醛进一步在 ALDH的催化下脱氢生成己酸，再经三羧酸循环途径氧化生成二氧化碳和水排出体外[3]。基因型GA和AA者，因不具有ALDH酶活性或酶活性下降,饮酒后可使乙醛氧化为乙酸延迟。乙醛损伤肝细胞可引起纤维变性，影响能量代谢并产生自由基，导致酒精中毒性肝炎、脂肪肝、纤维变性及肝硬化等。ALDH2基因的作用除与酒精代谢相关外，另发现其与人类各系统及其他疾病间也密切相关。

有文献报道ALDH2 是硝酸甘油(GTN)的有效代谢物一氧化氮 (NO)形成的关键[4]。试验表明,ALDH2基因在硝酸甘油对肺部及循环系统血管床的生物转化中发挥重要作用[5]，如果患者基因中携带有 ALDH2基因(Glu487Lys)突变,可使硝酸甘油在体内的生物转化过程受阻,药物难以有效发挥作用[6]。

另外，相关文献报道，ALDH2是不依赖乙醇的心血管疾病的独立影响因素，可通过减少活性氧簇(ROS)或解毒4-HNE途径抑制乙醛或缺氧而至的心肌细胞凋亡，对心功能不全和心肌病起到保护作用[7]。ALDH2缺陷型是冠心病的危险因素[8]，ALDH2野生型伴随着更高的高血压风险[9]。由此可见，ALDH2基因突变对多系统多类型疾病存在不良影响，ALDH2基因型检测，可了解是否为突变基因携带，对各系统疾病均具有重要的临床指导意义。有利于对心血管病高危人群进行宣教，进行早期预防及干预；可指导硝酸甘油临床用药；以及在筛选酒精易感人群并采取有效的保护和干预措施等方面都具有潜在的应用价值。

本研究共检测样本100例，测出野生纯合型(GG型)72例；杂合突变型(GA型)26例；突变纯合型(AA型)2例。结合有关文献报道，江春晓等[10]曾检测231例样本，测出野生型145例,突变型86例；曹西蓉等[11]检测60例，测出(GG型)37例，(GA型)21例，(AA型)2例，提示ALDH2基因存在较高的突变率。

基因检测方法多样，目前线粒体ALDH2基因多态性检测方法主要有：PCR产物限制性酶切片段长度多态性(PCR-RFLP)和直接测序法。PCR-RFLP法的缺点是测定时间长、PCR反应产生的气溶胶极易对其他标本产生污染、不能进行自动化的分析、结果的判读受到人为因素的影响等。测序法需要特殊的仪器和专门的操作人员，不适合在临床实验室应用[12]。本研究采用芯片检测法，该方法由DNA提取、杂交仪杂交、芯片扫描几个步骤组成,有以下几个优点:(1)各试剂在杂交仪内自动完成杂交、洗涤，一份标本一张芯片，避免了人工操作的污染，并且有效节省工作时间；(2)扫描仪自动分析图像，避免了人为判断的误差，相较传统方法较高效准确；(3)基因组DNA及PCR扩增产物经电泳分析证实为ALDH2基因，经测序验证，证实芯片检测结果与测序结果吻合，表明芯片检测结果可信；(4)实验操作简便，易于实验人员掌握；(5)相较于传统检测方法，芯片法的出现表明现代化检测技术在不断优化成熟。综上所述，表明芯片检测法快捷、高效、准确、先进，能满足临床对ALDH2基因检测的需求，是值得临床推广的一项新兴基因检测技术。本实验的不足之处：本研究方法属于临床实验性研究，样本量尚小，且限制在体检人群，下一步拟将扩大样本量，纳入临床各系统疾病患者，进一步观察ALDH2基因多态性芯片检测法在临床多系统疾病方面的指导意义。

参考文献

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[7]潘强强,高琴,王洪巨.乙醛脱氢酶2与心血管疾

病研究进展[J].中国老年学杂志，2013,33(18):1962-1964.

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Gene chip method for detecting ALDH2 gene polymorphism among populations of healthy physical examination*

XuXiaojing1,QuHao2,ZhangHua1△

(1.DepartmentofClinicalLaboratory;2.DepartmentofNeurology,GuizhouProvincial

People′sHospital,Guiyang,Guizhou550002,China)

Abstract:ObjectiveTo adopt the gene chip method to detect the ALDH2 gene polymorphism for evaluating the feasibility of this method used in clinical detection.Methods100 individuals undergoing the healthy physical examination were selected as the detection objects.The gene chip method was adopted to detect the genotype GG,GA and AA in 487 mutation loci of ALDH2 gene.Results72 cases of GG type,26 cases of GA and 2 cases of AA were detected out.ConclusionThe gene chip method could meet the requirements of clinical ALDH2 gene detection with better clinical application prospect.

Key words:aldehyde dehydrogenase 2 gene;gene chip

(收稿日期：2015-07-22)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.01.005

文献标识码：A

文章编号：1673-4130(2016)01-0011-03

*基金项目：贵州省科技厅社发与科技攻关项目(黔科合LS字[2011]011号)。

作者简介：徐筱婧，女，初级检验技师，主要从事分子生物学研究。△通讯作者，E-mail：780837482@qq.com。