靓精对猪精子、卵母细胞和胚胎的影响

2016-02-25陈丹朔薛振华张振南王晓东张桢妮王书敏田见晖李树静

黑龙江动物繁殖 2016年1期

关键词：卵母细胞精子胚胎

陈丹朔，薛振华，张振南，王晓东，张桢妮，王书敏，安　磊，云　鹏，田见晖*，李树静，4*

(1.河北农业大学动物科技学院，河北保定 071001；2.中国农业大学动物科技学院，北京 100094；

3.北京市畜牧总站，北京 100107；4.北京安伯胚胎生物技术中心，北京 100107)

靓精对猪精子、卵母细胞和胚胎的影响

陈丹朔1，2，薛振华3，张振南1，王晓东2，张桢妮2，王书敏2，安磊2，云鹏3，田见晖2*，李树静1，4*

(1.河北农业大学动物科技学院，河北保定 071001；2.中国农业大学动物科技学院，北京 100094；

3.北京市畜牧总站，北京 100107；4.北京安伯胚胎生物技术中心，北京 100107)

摘要：靓精是一个消毒剂的新产品，可用于精液常温保存过程的微生物污染的预防。为了确认靓精对精子、卵子以及早期胚胎的影响，本实验利用病原抑制实验筛选出的三个靓精浓度，0.5%(v/v)、0.75%和1%，并分别添加至精液稀释液、卵母细胞成熟培养液、胚胎的培养液中，观察靓精对猪卵母细胞的成熟、胚胎发育、精子活力以及受精能力等的影响。结果表明，三个处理浓度的靓精对卵母细胞的成熟质量、体外发育能力，精子的运动和受精能力均无显著影响。因此，靓精作为广谱消毒剂，可以在猪精液常温保存过程中添加，以改善精液保存品质。

关键词：靓精；猪；精子；卵母细胞；胚胎

资助项目：现代农业产业技术体系北京市生猪产业创新团队项目(25015015)

李树静(1963-)，男，博士，教授。

E-mail:lshujing@hotmail.com

猪人工授精技术是集约化养猪的关键技术，可大幅提高优良种公猪利用效率。精液在常温保存过程中有可能受到微生物的污染，从而影响输精效果。因此，在精液中添加对精子、卵子以及胚胎没有毒性，而对微生物具有抑制作用的消毒剂，可以通过提高精液品质来改善人工输精效果[1]。聚维酮碘为碘伏的一种，是表面活性剂聚乙烯吡咯烷酮(PVP)与碘的复合物[2]。聚维酮碘对真菌、病毒和革兰氏阴阳性菌都具有杀灭作用[3，4]。靓精是一个消毒剂的新产品，其主要成分为聚维酮碘(PVP-I)，可用于精液常温保存过程的微生物污染的预防。

1材料与方法

1.1　实验材料

1.1.1卵巢的采集

猪的卵巢取自位于北京郊区的屠宰场。将离体的卵巢及时放入装有含双抗(青霉素和链霉素，各1 000单位/mL)的37℃生理盐水的保温瓶中，3 h内运回实验室。

1.1.2猪的精液

猪的精液取自北京中顺景盛种猪改良有限公司。

1.2　主要化学试剂

本研究用于精液保存、卵母细胞成熟、受精、激活以及胚胎发育所涉及的生化试剂除标注外均购自Sigma公司。配制各种液体所用的水均为经MilliQ过滤的超纯水。

1.3　实验方法

1.3.1卵母细胞体外成熟

将取回的卵巢用含双抗的灭菌生理盐水清洗3次，放入38℃的水浴锅中，使用20 mL的注射器从卵巢表面上直径为3~6 mm的卵泡中抽取卵丘卵母细胞复合体(COCs)，将抽取液放于15 mL离心管中，38℃水浴静置至完全沉淀，洗卵液TL清洗两次，显微镜下捡取包裹有3层以上卵丘细胞的COCs。

将挑选好的卵母细胞移入覆盖有矿物油且预先平衡2 h以上的M199中洗3次，再移入覆盖矿物油且平衡好的M199滴中，每滴60 μl，放入20~15个卵母细胞，培养48 h，培养条件为5% CO2的空气，38.5℃及100%相对饱和湿度。

1.3.2卵母细胞孤雌激活及体外培养

将脱去卵丘的成熟卵母细胞，先用事先预热的融合/激活液洗涤3遍，之后将其转移到已经铺满激活液的融合槽中，施加电脉冲进行电激活，之后放入平衡2 h以上含CB和CHX的PZM-3培养滴中洗3次，再放入相同溶液的培养滴中进行化学辅助激活，4 h后移出并用PZM3 培养液洗涤3遍，转移到矿物油覆盖并预先在 5% CO2培养箱中平衡至少2 h以上的PZM3 发育液滴中继续培养。38.5℃，5% CO2，饱和湿度下培养48 h和168 h分别记录卵裂和囊胚形成结果。

1.3.3精液的处理

实验前一天取回精液后，首先取出2 mL放入管中，并置于37℃水浴锅中，20~30 min后检测精子活力和密度，精液于17℃恒温箱中保存。实验当天，取10 mL精液加入离心管中，1 000 r/min离心5 min，弃上清，加入预热的PBS-BSA洗一次，1 000 r/min离心5 min，弃上清，将沉淀吸出放入含有获能液的离心管中，呈45°放入培养箱获能，30 min后取出检测精子活力及密度。

1.3.4体外受精

将成熟好的COCs脱去颗粒后放入受精液滴中，每滴50 μl，放入15~20个卵母细胞，然后放入50 μl获能的精液。放入5% CO2，38.5℃及100%相对饱和湿度的培养箱中受精，6 h后将卵母细胞移入平衡4 h以上的胚胎培养液中洗去精子，再换入新的胚胎培养液中培养。38.5℃，5%CO2，饱和湿度下培养48 h和168 h分别记录卵裂和囊胚形成结果。

1.3.5卵母细胞染色(DAPI)

成熟44 h的卵母细胞在透明质酸酶中脱去颗粒细胞，放入4%PFA中固定45 min，然后在含0.1%PVA的PBS中洗3次，每次5 min，接着使用DAPI染色，5 min后压片，观察结果，以排出第一极体认为成熟。

1.3.6囊胚细胞计数及凋亡染色

使用TUNEL试剂盒染色。囊胚先于含0.5%Triton的4%PFA中固定通透，37℃，45 min；染色液为试剂一(Label)和试剂二(Enzyme)以9：1的体积比混合，固定好的囊胚在含0.1%PVA的PBS中洗3次，每次5 min，接着在染色液中染色1 h，PBS-PVA洗3次，最后DAPI染色5~10 min。

1.3.7精子检测方法

使用计算机辅助精液分析(CASA)进行精液检测。采精后6 h进行首次检测，之后每12 h检测一次。

1.3.8统计分析

数据结果用平均数±标准差表示，利用 SPSS 20.0 中 One Way-ANOVA过程对数据进行分析处理。

2结果

2.1　靓精预处理对卵母细胞成熟的影响

实验共分4组：处理组成熟液分别添加浓度0.5%(v/v)、0.75%和1%的靓精，正常成熟液作为对照组。卵母细胞在不同成熟液中预处理1 h后全部移入正常成熟液，对成熟44 h卵母细胞分别通过DAPI染色和孤雌激活评价其成熟率及卵母细胞后期发育能力。

结果如表1和表2所示，不同浓度靓精处理后，卵母细胞成熟率与对照组间没有显著差异；对后期发育结果统计发现，所有组间卵裂率和囊胚率都没有显著差异，然后对囊胚进行TUNEL染色统计囊胚总细胞数和凋亡细胞数，均未发现显著差异。

表1M199中添加靓精对卵母细胞成熟率的影响

组别培养卵/枚成熟卵/枚成熟率/%对照1138676.11±3.730.5%1199478.99±5.010.75%1138877.88±3.641%1179076.92±3.44

注：组间没有显著差异(P>0.05)，表中成熟率数据为平均数±SD。

表2M199中添加靓精对卵母细胞孤雌后发育能力的影响

组别孤雌卵/枚卵裂率/%囊胚率/%囊胚细胞/个凋亡细胞/个对照249168(67.46±2.21)85(34.08±3.1)69±1.732.37±0.190.5%243157(64.61±1.62)79(32.62±0.8)68.09±1.262.56±0.240.75%264173(65.53±1.82)97(36.81±1.4)67.72±1.252.69±0.171%264164(62.12±2.12)79(29.86±1.3)66.25±1.372.5±0.14

注：组间没有显著差异(P>0.05)

2.2　靓精预处理对孤雌胚胎发育的影响

卵母细胞电激活后，放入含有靓精和正常的化学辅助激活药物的培养液滴中，4 h后全部换至正常胚胎培养液中培养。

结果显示对照组的卵裂率(61.22%)和囊胚率(35.54%)与添加靓精的实验组间均无显著差异，4组囊胚染色后总细胞数和凋亡细胞数间同样没有显著差异(表3)。

表3PZM-3中添加靓精对卵母细胞孤雌后期发育的影响

组别孤雌卵/枚卵裂率/%囊胚率/%囊胚细胞/个凋亡细胞/个对照228139(61.22±2.4)81(35.54±1.1)67.08±2.31.78±0.10.5%244146(59.95±2.1)80(33.02±1.2)65.23±1.12.29±0.140.75%237140(59.19±1.9)88(36.98±0.8)68.39±1.62.03±0.161%241135(56.15±0.4)75(31.34±2.6)64.08±0.82.38±0.13

注：组间没有显著差异(P>0.05)

2.3　精液稀释液中添加靓精对精子的影响

利用添加不同浓度靓精的精液稀释液对采集到的公猪原精液进行稀释，借助CASA系统对精子运动特性进行评价，6 h进行首次检测，之后间隔12 h检测一次。从表4中可以发现在30 h时0.75%靓精处理组的直线运动精子活率显著高于1%组，而与其他两组间无显著差异。42 h时0.75%靓精处理组的精子活率显著高于对照组，而与0.5%及1%两组间没有显著差异；并且0.75%靓精处理组的A+B级精子比例显著高于对照组和0.5%组；而0.75%组的直线运动精子活率显著高于其他3组。

2.4　精液稀释液中添加靓精对体外受精的影响

精子经添加不同浓度靓精的精液稀释液稀释后放置一天，用于体外受精。卵母细胞未经靓精处理，用于评价靓精处理对精子受精能力的影响。

结果如表5所示，含不同浓度靓精的精液稀释液稀释的精液用于体外受精后，观察结果发现对照组卵裂率(61.08%)和囊胚率(21.62%)与其他3组间没有显著差异；进一步进行囊胚凋亡染色，发现囊胚细胞数和凋亡细胞数间也都没有显著差异。

3讨论

靓精的主要成分为聚维酮碘，而聚维酮碘属卤素类消毒剂对革兰氏阴性、阳性菌、真菌和病毒具有广谱杀灭作用。研究表明，PVP-I对于常见的肠道杆菌、革兰氏阴性杆菌、芽孢、病毒、螺旋体、革兰阳性球菌等微生物均有良好的杀灭效果，且很少出现耐药性反应[3，4]。每毫升猪鲜精中通常含有104~105个细菌，而鲜精中微生物指标往往是影响精液的保存时间和品质的关键[6]，在被感染的猪精液中发现的许多病毒被报道与不孕或降低繁殖力相关[7]。

本实验通过不同浓度靓精处理对精子活力、卵母细胞成熟、胚胎发育等指标的评价，系统地评估靓精是否会对精子的运动及受精能力产生不利影响，以及精液稀释液中的靓精残留是否会对卵母细胞及胚胎的发育能力产生影响。

表4精液稀释液中添加靓精对精子的影响

时间组别重复次数检测项目精子活率/%A+B/%直线运动精子活率/%VCL(μm/s)VSL(μm/s)ALH(μm/s)LIN/%6hC683.52±3.3478.90±5.1145.99±10.2936.30±3.0224.92±2.434.15±0.0568.76±5.420.5%685.50±5.8879.18±10.3052.74±4.0534.82±6.4623.38±4.854.14±0.0467.07±4.650.75%684.83±4.9579.43±9.9552.70±5.2236.34±4.1822.97±5.214.10±0.0862.70±8.621%680.91±3.6874.17±6.2350.12±3.9039.03±4.6225.10±3.154.11±0.0364.31±3.6318hC672.86±4.1662.64±9.8737.20±7.2335.84±4.4821.95±4.174.08±0.0861.12±8.480.5%677.12±5.9567.82±11.8940.56±8.2240.68±4.8623.94±4.174.06±0.0558.69±6.030.75%676.32±3.9370.82±6.0242.19±6.3538.48±7.3922.86±7.584.06±0.0758.22±8.151%677.34±5.3969.15±8.4638.61±5.4234.06±5.9722.43±6.134.07±0.1359.15±14.9930hC665.61±10.4956.23±9.7429.06±6.55ab37.59±3.8822.24±3.614.06±0.0559.01±5.830.5%673.41±6.1665.77±10.7929.69±3.13ab37.86±3.4523.08±5.004.08±0.1060.65±10.840.75%673.42±2.2964.87±5.4033.20±6.47a37.05±7.3022.42±6.144.07±0.0559.78±5.701%667.99±6.4460.70±8.4725.30±2.84b35.96±4.2521.98±4.604.08±0.1060.35±11.0842hC660.62±6.47a49.67±9.23a21.95±5.37a32.85±2.9918.85±2.974.05±0.0657.29±6.650.5%664.47±5.48ab50.67±6.61a24.35±5.32a32.58±3.3620.82±3.214.11±0.0563.71±5.610.75%671.05±2.08b62.63±7.93b30.21±4.82b31.40±4.6617.77±4.804.04±0.0855.94±8.921%664.51±1.94ab56.45±6.40ab20.85±3.63a34.01±5.1619.53±3.574.05±0.0757.60±8.26

注：同时间同列数据肩标的不同字母表示差异显著(P<0.05)，表中数据为平均数±SD。A+B表示根据精子运动速度所得快速前向运动精子(A级)和慢速或呆滞前向运动精子(B级)的比例之和。平均曲线运动速度(Curvilinear velocity，VCL)：即精子头部沿其实际行走曲线运动的速度。平均直线运动速度(Straight line velocity，VSL)：也称前向运动速度，即精子头部直线移动距离的速度。精子平均侧摆幅度(Amplitude of lateral head displacement，ALH)：精子头实际运动轨迹对平均路径的侧摆幅度。运动的直线性(Linearity，LIN)：也称线性度，即精子运动曲线的直线分离度，即 VSL/VCL。

表5精液稀释液中添加靓精对IVF的影响

组别重复次数受精卵/枚卵裂率/%囊胚率/%囊胚细胞/个凋亡细胞/个对照4167102(61.08±2.9)36(21.62±1.3)55.06±1.11.86±0.080.5%4165102(61.82±1.4)38(22.89±0.9)50.90±1.91.80±0.130.75%4165105(63.64±0.9)38(23.12±1.5)56.56±2.02.09±0.111%416498(59.76±1.4)33(20.12±1.8)48.99±1.22.33±0.17

注：组间没有显著差异(P>0.05)，表中数据为平均数±SD。

研究表明猪卵母细胞的成熟质量会影响到其受精或孤雌后的胚胎发育能力，而排出第一极体可作为猪卵母细胞成熟的标志[8]。本实验中成熟率的统计就是通过对成熟培养44 h后的卵母细胞进行DAPI染色观察第一极体的排出率而得出的。结果显示，卵母细胞在含不同浓度靓精的成熟培养液中培养1 h后，再恢复正常成熟液进行体外成熟后的成熟率与对照组间没有显著差异。这提示在实际应用中，精液稀释液中少量的靓精残留不会对卵母细胞产生不良影响。同时观察到无论是在成熟培养液中还是在胚胎培养液中添加靓精，胚胎的卵裂率、囊胚率及囊胚总细胞数、凋亡细胞数在各组间都没有显著差异。结合这些结果表明靓精不会危害卵母细胞的成熟及其后续发育能力。

影响精液质量及精子活率的因素很多，包括温度、稀释液pH值和化学成分等[9]。本实验中添加靓精至精液稀释液中，使用计算机辅助精液分析系统(CASA)检测精子指标[10]。结果显示，添加0.75%的靓精可以延长精子的保持较高活率的时间，这可能是靓精通过抑制微生物的繁殖，降低了微生物对精子保存的不利影响。更重要地是，通过体外受精实验，证实了靓精处理不会影响精子的受精能力和受精后胚胎的发育能力。

在本实验中，0.75%的靓精对猪卵母细胞的成熟及后期发育，以及精液保存无不良影响。上述结果初步提示，在实际生产中使用靓精不会对精子和卵母细胞受精及胚胎发育能力产生不良影响。但在实际生产中，其最佳处理浓度及相关影响，仍需要通过人工授精试验来确认。

参考文献4

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