米诺环素改善血管性痴呆大鼠认知功能障碍的机制研究

庞慧 刘怡 韩冰 付强

·基础研究·

米诺环素改善血管性痴呆大鼠认知功能障碍的机制研究

庞慧 刘怡 韩冰 付强

目的探索米诺环素是否在血管性痴呆导致的认知功能损害发生发展中发挥一定的神经保护作用，并进一步分析参与其中的相关分子机制。方法SD大鼠随机分为假手术组、模型组和米诺环素治疗组。结扎双侧颈总动脉建立大鼠血管性痴呆模型，术后腹腔注射米诺环素（25，50 mg/kg），28 d后进行水迷宫行为学实验检测认知变化，HE染色和Western blotting分析大鼠海马神经细胞凋亡的相关机制。结果（1）水迷宫认知功能测试显示，米诺环素能够显著缩短血管性痴呆大鼠寻找平台的潜伏期，并且明显延长在目标象限的停留时间，P＜0.05为差异具有统计学意义。（2）HE染色显示米诺环素能够显著减轻模型组大鼠海马神经细胞损伤。（3）米诺环素治疗组含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3（Caspase-3）蛋白表达水平及Bax/Bcl-2比值较模型组明显下降，P＜0.05为差异具有统计学意义。（4）与模型组相比，米诺环素组磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）及磷酸化蛋白激酶B（p-AKT）蛋白表达水平明显升高，磷酸化糖原合酶激酶-3β（p-GSK-3β）蛋白表达却显著下降，P＜0.05为差异具有统计学意义。结论米诺环素通过激活PI3K/AKT信号通路，抑制该通路下游靶分子GSK-3β活性，减少海马神经细胞凋亡的发生，在神经细胞保护和改善认知功能障碍中发挥重要作用。

米诺环素；血管性痴呆；磷脂酰肌醇-3激酶；蛋白激酶B；糖原合酶激酶-3β

血管性痴呆（vascular dementia，VD）是目前继老年性痴呆之后，临床发病率排在第二位的认知功能障碍性疾病[1]。米诺环素作为半合成的第二代四环素，由于其具有较高的脂溶性，易通过血脑屏障，故可用于治疗多发性硬化症、阿尔兹海默病、帕金森病和脑损伤等中枢神经系统疾病[2,3]，但是米诺环素对于血管性痴呆认知功能障碍的影响目前尚不清楚。本研究以结扎双侧颈总动脉制备血管性痴呆大鼠模型为基础，从海马神经细胞凋亡的角度，探索米诺环素是否在血管性痴呆导致的认知功能损害发生发展中发挥一定的神经保护作用，并进一步分析参与其中的相关分子机制。

材料与方法

一、大鼠血管性痴呆模型的制备

清洁级雄性200 g的SD大鼠（徐州医学院动物中心提供）随机分为三组，假手术组（Sham）、血管性痴呆模型组（VD）、米诺环素（Sigma，USA）治疗组。SD大鼠术前禁食过夜，自由饮水，10%水合氯醛腹腔麻醉后结扎双侧颈总动脉。术后腹腔注射米诺环素（25，50 mg/kg）每天给药一次直至动物被处死。术后28 d，进行Morris水迷宫行为训练及测试，处死后取海马组织，检测相应指标。

二、Morris水迷宫行为学实验

术后28 d进行Morris水迷宫训练，连续4 d，每天训练4次，2次训练之间间隔15～20 min。Morris迷宫直径180 cm、高60 cm、水深40 cm的水池，水温保持在25±1℃。用摄像仪监测游泳活动，并通过相连接的计算机进行数据处理分析。

1.定位航行试验：每次均随机从4个不同象限的中点将大鼠头朝池壁放入水中，平台设在第IV象限的中央，如大鼠60 s内找到并爬上平台，让其在平台上停留30 s。如60 s内未能找到平台，则由实验者用工具将其引导至平台，同样让其在平台上停留30 s。逃避潜伏期为大鼠从入水到找到平台的时间，取每天训练所记逃避潜伏期的平均值作为当日的逃避潜伏期。

2.空间探索试验：训练4 d后撤除平台，将大鼠从第IV象限对侧象限的中点头朝池壁放入水中，任其在水中自由游泳120 s，记录大鼠在原站台象限的停留时间，观察受试大鼠的空间定位能力，及在空间探索过程中的变化规律。

三、大鼠脑组织标本制备及HE染色

大鼠麻醉后，开胸经左心室插入灌流针并固定，切开右心耳，先灌注4℃生理盐水，直到肝和肺脏颜色转白及右心房流出液澄清，再灌注4℃的4%多聚甲醛，完毕后断头取脑，4%多聚甲醛浸泡固定24 h。常规梯度乙醇逐级脱水，二甲苯透明，石蜡包埋、切片。染色前，组织切片常规脱蜡，再经由高浓度到低浓度酒精，最后入蒸馏水，即可HE染色，最后中性树胶封片。

四、大鼠海马组织中相关蛋白表达水平的Western blotting检测

大鼠断头取脑，分离出的海马组织与组织匀浆液混合后用玻璃匀浆器充分匀浆，4℃，1 500g离心5 min，取上清，用BCA法测定蛋白浓度，-80℃冻存备用。取总蛋白量一致的各样品加入等体积的蛋白上样缓冲液，置沸水浴中变性处理。变性蛋白质样品，经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，以半干转法电转至硝酸纤维素膜上。将硝酸纤维素膜置封闭液中室温孵育后，加入一抗，4℃过夜，三乙醇胺缓冲盐水溶液洗膜后加入碱性磷酸酶（AP）标记的二抗，室温孵育2 h，TBST洗膜，水洗。使用BCIP/NBT显色试剂盒显色，流水洗涤终止反应。

五、统计学分析

采用SPSS19.0软件进行统计学分析，定量资料以均数±标准差表示，两样本均数间比较t检验，多个样本均数间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

一、Morris水迷宫实验结果

水迷宫实验中VD大鼠寻找平台的潜伏期明显长于假手术组，差异有统计学意义（P＜0.05）；米诺环素治疗后大鼠寻找平台潜伏期较VD组显著缩短，差异有统计学意义（P＜0.05）。空间探索试验中，VD大鼠在目标象限的停留时间显著短于假手术组，差异有统计学意义（P＜0.05）；米诺环素治疗组大鼠在目标象限的停留时间较VD组明显延长，差异有统计学意义（P＜0.05）。提示米诺环素能够减轻血管性痴呆大鼠记忆力的损害（图1、2）。

二、大鼠海马CA1区HE染色形态学观察

假手术组大鼠海马CA1区锥体细胞密度大，排列整齐紧密，细胞核大而圆，核仁清晰，染色质丰富，胞浆清亮。血管性痴呆大鼠海马CA1区锥体细胞数目减少，稀疏分布，排列散乱，层次不完整，细胞核体积变小、深染，呈核固缩表现，核仁消失，细胞质呈强嗜酸性。米诺环素干预后海马CA1区细胞形态变化较轻，病理改变轻微，个别神经元变性、坏死（图3）。

三、米诺环素对血管性痴呆大鼠海马凋亡相关蛋白表达的影响

与假手术组大鼠相比较，VD大鼠Bax及含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3（cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase-3）蛋白表达水平显著升高，而Bcl-2蛋白表达则明显下降，差异有统计学意义 （P＜0.05）。VD大鼠经米诺环素治疗后Bax及Caspase-3蛋白表达水平显著下降，Bcl-2表达水平显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。Bax/Bcl-2灰度比值，VD组高于假手术组，但米诺环素治疗组Bax/Bcl-2比值较VD组明显下降，差异有统计学意义（P＜0.05）（图4）。

四、米诺环素对血管性痴呆大鼠海马PI3KAKT-GSK-3β蛋白表达的影响

VD组大鼠较假手术组大鼠磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）及磷酸化蛋白激酶B（phosphorylated protein kinase B，p-AKT）蛋白表达量显著降低，糖原合成酶激酶 3β（glycogen synthase kinase-3，GSK-3β）蛋白表达量却明显增高，差异具有统计学意义（P＜0.05）。米诺环素治疗后，与VD组相比较，PI3K及p-AKT蛋白表达水平明显升高，p-GSK-3β蛋白表达却显著下降，差异具有统计学意义（P＜0.05）（图5）。

图1 米诺环素对血管性痴呆大鼠寻找平台潜伏期的影响

图2 米诺环素对血管性痴呆大鼠在目标象限停留时间的影响

图3 大鼠海马CA1区病理形态比较（HE染色，×400）

讨论

血管性痴呆是一组获得性智能损害的临床综合征，由于脑血管病和心血管病导致脑功能障碍慢性、进行性颅内、外血管的直接、间接病变，是脑动脉硬化性痴呆[4]。近年来随着血管性痴呆的发病率日益升高，现已严重威胁人类的健康。长期慢性脑供血不足是血管性痴呆形成的重要因素之一，结扎大鼠双侧颈总动脉是典型的通过慢性缺血制备血管性痴呆动物模型，其中的海马是缺血效应最为敏感的脑区之一[5]。

米诺环素现已证实对于多种中枢神经系统疾病具有广谱的抗炎、抗凋亡、抗氧化及血管保护作用[6]。最近一项研究发现，在小鼠皮层下缺血性血管性痴呆模型的早期和后期，米诺环素能促进少突胶质细胞前体细胞数目的增加，同时抑制成熟少突胶质细胞的丢失。但在疾病中期，米诺环素却明显减少少突胶质细胞前体细胞的数目，对成熟少突胶质细胞无明显作用。由此可见，米诺环素对皮层下缺血性血管性痴呆后白质损伤和认知功能障碍的这种保护作用呈现阶段依赖性[7]。另外，有报道指出米诺环素对于幼龄大鼠全脑照射诱发的神经细胞凋亡有显著的抑制作用，减少照射后短期内新生神经细胞的丢失，同时还能改善全脑照射后导致的认知功能损害，发挥其神经保护作用[8]。淀粉样蛋白β是阿尔兹海默病的主要致病物质，它在脑内过度产生和沉积，引起神经元突触功能障碍、Tau蛋白过度磷酸化和继发炎性反应，导致神经元变性死亡，最终产生痴呆。阿尔兹海默病小鼠经米诺环素治疗后，淀粉样蛋白β的水平降低，继发的炎性反应被抑制，认知功能障碍得到一定程度的改善，但是米诺环素对于降低Tau蛋白过度磷酸化疗效不显著[9]。

图4 Western blotting检测大鼠海马凋亡相关蛋白表达

图5 Western blotting检测大鼠海马PI3K-AKT-GSK-3β蛋白表达

本研究中水迷宫行为学实验发现VD大鼠寻找平台潜伏期延长，空间探索试验数据显示大鼠在目标象限的停留时间缩短，提示VD大鼠的学习记忆能力较正常大鼠显著下降。但米诺环素却能在一定程度上改善VD大鼠的认知功能障碍。海马是大脑中主要负责学习和记忆的区域，与记忆、压力调节和空间导航密切相关。因此，海马区功能损伤会严重影响人和动物的学习记忆功能[10]。本研究通过检测Bax、Bcl-2及Caspase-3蛋白表达水平，并同时结合Bax/Bcl-2的比值反应海马神经细胞凋亡倾向。与Bax、Bcl-2蛋白绝对表达水平相比，Bax/Bcl-2比值能够更加准确的反应细胞凋亡。结果提示，VD大鼠的认知功能障碍与海马区细胞过度凋亡密切相关，而米诺环素能够显著抑制VD大鼠海马神经细胞的凋亡。由此笔者推断，米诺环素改善VD大鼠的认知功能障碍可能与它对海马神经细胞的抗凋亡密切相关。

PI3K蛋白参与增殖、分化、凋亡和葡萄糖转运等多种细胞功能的调节。PI3K为异源二聚体，由一个调节亚基和一个催化亚基组成。AKT为PI3K下游主要的效应物，PI3K激活后产生第二信使磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸，进而磷酸化 AKT蛋白的Ser308导致AKT活化。活化的AKT通过磷酸化多种酶、激酶和转录因子等下游因子，进而调节细胞的功能[11]。GSK-3β是一种可磷酸化抑制糖原合成酶的丝/苏氨酸蛋白激酶，是糖原合成的关键调控酶，脑内分布广泛，在皮层锥体细胞层、海马锥体细胞层、齿回颗粒层、纹状体及丘脑等区域分布较为密集。GSK-3β是PI3K/AKT和Wnt/β-catenin细胞信号通路的关键组成部分，参与细胞黏附功能调节、细胞分化与增殖、细胞凋亡等[12]。

研究发现，VD组大鼠较假手术组大鼠PI3K及p-AKT蛋白表达量显著降低，p-GSK-3β蛋白表达量却明显增高。米诺环素治疗后，与VD组相比较，PI3K及p-AKT蛋白表达水平明显升高，p-GSK-3β蛋白表达却显著下降。笔者由此推断，米诺环素通过激活PI3K/AKT信号通路，抑制该通路下游靶分子GSK-3β活性，减少海马神经细胞凋亡的发生，在神经细胞保护和改善认知功能障碍中发挥重要作用。以上研究探索米诺环素抗菌作用外神经保护的新领域，为治疗血管性痴呆的新机制和防治的新策略提供一定的理论基础。

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Minocycline prevents cognitive impairment in a rat model of vascular dementia

Pang Hui,Liu Yi,Han Bing,Fu Qiang.Department of Cardiovascular Medicine,XuZhou Central Hospital,Xuzhou 221009,China

Pang Hui,Email:phui81@126.com

ObjectiveTo explore the neuroprotective effect of minocycline on cognitive impairment in a rat model of vascular dementia(VD)and its potential molecular mechanism.MethodsSD male rats were randomly divided into the sham-operation group,vascular dementia group and minocycline treated group.Rats were administered with minocycline by intraperitoneal injection after the surgery of bilateral common carotid artery occlusion.After 28 days,the Morris water maze test was carried out to test the spatial learning and memory ability of rats.The morphological changes of brain were observed by HE staining.Western blot was used to evaluate apoptosis mechanism of rat hippocampal neurons.Results(1) Minocycline treatment to VD rats significantly shortened the escape latency compared to the VD rats.In addition,Minocycline treated group spent more time in the target quadrant than the VD rats(P＜0.05).(2)HE staining showed that minocycline could obviously protect the hippocampal neurons against damage in VD rats.(3)The protein expression of caspase-3 and Bax/Bcl-2 ratio in the minocycline administration group were significantly lower than those of the VD group(P＜0.05).(4)Although minocycline decreased p-GSK-3β expression relatively to the VD group,the protein expression of PI3K and p-AKT in the minocycline treated group was significantly higher than that of the control group(P＜0.05).ConclusionMinocycline protects against apoptosis of hippocampal neurons via the activation of PI3K/AKT signaling pathway and the inhibition of downstream target protein GSK-3β activity.Minocycline can play an important role in the protection of hippocampal neurons and the improvement of cognitive dysfunction.

Minocycline；Vascular Dementia；PI3K；AKT；GSK-3β

2016-03-05）

（本文编辑：张丽）

10.3877/cma.j.issn.2095-9141.2016.04.008

221009徐州，徐州市中心医院心内科

庞慧，Email：phui81@126.com

庞慧,刘怡,韩冰,等.米诺环素改善血管性痴呆大鼠认知功能障碍的机制研究[J/CD].中华神经创伤外科电子杂志,2016,2 (4):223-227.