干热河谷根瘤菌对台湾相思无菌苗生长的影响

王芳 高瑾 张东华 马焕成 伍建榕

摘要：为了探讨不同根瘤茵对台湾相思幼苗的影响，采用分离自干热河谷地区野生豆科树种根瘤的根瘤菌菌株接种到台湾相思盆栽无菌幼苗上，60天后，测定台湾相思幼苗的苗高、地径，并对其结瘤情况进行了统计，结果表明，接种不同根瘤菌菌株对台湾相思幼苗的苗高及地径生长的影响是不同的，且与菌株的系统发育地位无关，其中接种菌株sxfu-02对台湾相思幼苗的生长有较大的促进作用，其结瘤率也最高，可初步评选为促进台湾相思幼苗生长的根瘤菌菌株。

关键词：干热河谷；台湾相思；根瘤茵；生长

豆科树台湾相思（ Acacia confusa）别名相思树、台湾柳，为多年生豆科常绿乔木。分布于我国台湾、福建、广东、广西、云南等省区，菲律宾、印尼、斐济也有分布。台湾相思树高可达15～18 m，胸径可达70cm，树干稍弯，最喜光，畏寒，生长迅速且萌发力强，极耐干旱和瘠薄。根系发达，根深材韧，抗风力强，并且根系有根瘤，能固定大气中的游离氮，改良土壤营养结构，是荒山荒地造林的先锋树种，已逐渐成为西部干热河谷地区的主要造林树种刚。干热河谷地带由于其干旱、高温、土壤瘠薄等立地条件的限制，决定了在该地区造林工作的特殊性和艰巨性。因此，除了在树种的选择上尽量做到适地适树，对于相应树种共生的根瘤菌的应用也需筛选适合该地区生态特点的菌株。在相同立地条件下，筛选固氮效率高且能促进苗木生长的根瘤菌，对提高现有共生体系的固氮效率有重要的实际意义。本文选取分离白相同立地条件下，干热河谷地区元阳、元江、元谋、东川及攀枝花5个地区的野生豆科树种根瘤的15株菌株为研究对象，进行了16SrRNA序列测定，并用MEGA软件构建了其系统发育树，通过分析15株供试菌株分别属于快生根瘤菌属（Rhizobium）、中慢根瘤菌属（Mesorhizobium）和慢生根瘤菌属（Bradyrhizobium），接着将这些菌株接种到相思盆栽无菌幼苗中，通过测定接种了不同菌株的台湾相思幼苗的结瘤状况及生长情况来研究根瘤菌对台湾相思幼苗生长的影响，筛选最能促进台湾相思幼苗生长的优良菌株，为进一步研究和合理利用干热河谷的固氮资源提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

本试验利用前期分离白干热河谷地区野生豆科植物根瘤的菌株，菌株信息见表l。

1.2 干热河谷台湾相思根瘤菌菌株的系统发育地位

将上述供试菌株活化后，转接于TY液体培养基，在摇床上28℃震荡培养制成菌液，收集菌体，用细菌基因组DNA提取试剂盒中供试菌株的DNA，利用引物Pl和P6，扩增16S rRNA基因。基因PCR扩增产物经电泳检测后，送生物公司直接测序。所得序列在GenBank数据库中利用Blastn软件在线比对，并下载相近的参比16S rRNA序列，在Mega软件中，采用邻接法（Neighhor-Joining），以Jukes&Cantor;模型构建系统发育树。

1.3 台湾相思幼苗培育

挑选籽粒饱满的台湾相思种子，用0.2%～0.5%的高锰酸钾液浸泡约20min进行表面消毒后，用清水冲洗2～3次，于40～60℃水浸泡24h，使种子充分吸水膨胀，然后点种在已灭菌的发芽皿中，放置在28℃恒温人工气候箱中催芽。待幼苗的胚根长至0.5～lcm时，将苗木移植到经过高压灭菌的沙质基质中，并浇灌无氮培养液。

1.4 根瘤菌的培养及台湾相思苗木接种 将上述15株干热河谷地区豆科树木根瘤菌菌株（见表1）接人YMA固体斜面培养基，在28℃培养3d，活化后，挑取菌体，接入YMA液体培养基，在摇床上280C震荡培养制成菌液，将菌液浇在长出真叶的种子周围，每个菌株接种6盆（6个重复）。同时培养不接种根瘤菌的苗木，作为接种有根瘤菌苗木的对照组（对照）。

1.5 生长指标的测定

待苗木长出根瘤后，即相思苗生长60d后，测定苗木的苗高、地径、叶片数及新发叶片的叶长及叶宽。用钢尺量取苗木的苗高，用千分尺量取苗木的地径，计算苗木的叶片数，并用直尺量取叶片的长度和宽度。

1.6 台湾相思幼苗的结瘤情况

测定苗木的生长指标后，取出苗木，记录每株植株的根瘤的个数、颜色、测量根瘤的直径，并转换求植株的结瘤率。结瘤率（%）=结瘤植株数/该处理总植株数×100。

2 结果与分析

2.1 干热河谷台湾相思根瘤菌菌株的系统发育地位

目前，细菌系统发育学研究的主要方法是16SrRNA全基因序列分析，而且该方法也是根瘤菌系统发育研究的首选方法。本研究中，挑选的15株干热河谷台湾相思根瘤菌采用Mega4.0分析软件对序列进行比对并构建其系统发育树（图1），所有的菌株均位于a一变形杆菌纲根瘤菌目的系统发育分支，并分别归属于根瘤菌属（Rhizobium）、中慢根瘤菌属（Mesorhizo-bium）及慢生根瘤菌属（Badyrhizobium）。

2.2 接种根瘤菌对台湾相思幼苗生长状况的影响

接种不同根瘤菌菌株后台湾相思幼苗的生长情况见表2。从表2可看出，不同根瘤菌对台湾相思幼苗生长的影响不同，在接种60天后，苗高、地径及叶片数都有不同程度的增加（与对照相比），增幅分别为5.19%～72.79%、3.88%～23.69%、10.35%～65.53%，众所周知，苗木的生长需要吸收氮素，在相同的处理条件（无氮营养液）下，接种根瘤菌的幼苗均比未接种的幼苗长势好，这说明根瘤菌的固氮作用促进了台湾相思幼苗的生长，但地径增加的幅度较小。对于苗高，增加幅度最大的是接种swfu-05菌株的幼苗，达72.79%，其次为接种swfu-01号和swfu-12号菌株的幼苗，均高于60%，最低的是接种swfu-04菌株的幼苗，低于10%。对于地径，其中增加幅度最大的是接种swfu-02菌株的幼苗，为23.69%，其次为接种swfu-05和swfu-01菌株的幼苗，分别为21.82%和17.52%，最低的是接种sWfu-07的幼苗，仅为3.88%。对于叶片数，增幅最大的是接种swu-01菌株的幼苗，为65.53%，其次为接种sWfu-08和swfu-02菌株的幼苗，均为55.18%，最低的是接种swfu-12，为10.35%。综上，接种菌株swfu-05和sw-fu -02，其苗高、地径、叶片数的增幅分别为72.79%、21.82%、44.84%和54.73%、23.69%、55.18%，接种菌株swfu-02对台湾相思幼苗的生长有更大的促进作用。

接种不同根瘤菌菌株的苗木与未接种根瘤菌的苗木（对照）的苗高、地径及叶片数的方差分析结果见表3。其方差分析结果显示，接种各根瘤菌菌株的台湾相思苗木与未经接种的对照相比，其苗木高的生长存在显著差异（O.01

2.3 接种根瘤菌台湾相思幼苗的结瘤情况统计

接种供试菌株的台湾相思，接种60d后，均可见根系根瘤，接种不同根瘤菌菌株后台湾相思幼苗的结瘤情况见表4。在台湾相思幼苗上的根瘤主要呈圆形、椭圆形，颜色多为淡黄色，接种菌株swfu-01及swfu-15为白色，为无效根瘤。从表4可看出，接种菌株sw-fu-02、swfu-05、swfu-10幼苗结瘤率最高，结瘤率均为100%；其次为接种菌株swfu-03、swfu-12及菌株sw-fu-09的台湾相思幼苗，结瘤率均为83.335。结瘤量最多的是接种菌株swfu-02的台湾相思幼苗，为9.33颗/株，其次是接种菌株swfu-03的幼苗，为8.67颗/株，其它结瘤状况均属中等。

3 结论与讨论

接种不同根瘤菌菌株对台湾相思幼苗的苗高、地径、叶片数的影响是不相同的，菌株swfu-01、swfu-02、swfu-05、swfu-08和swfu-12对其有较明显的效果，其中swfu-01、swfu-02、swfu-05和swfu-12分属于慢生根瘤菌属，sWfu-08分属于中慢生根瘤菌属，可见不同根瘤菌株的系统发育地位与台湾相思幼苗的生长情况没有直接关系。接种菌株swfu-02的幼苗的长势最好，结瘤数目及结瘤率也相对较高。从苗高、地径及叶片数的增幅来看，接种菌株sWfu-02对台湾相思幼苗的生长有较大的促进作用，可初步评选为促进台湾相思幼苗生长的根瘤菌菌株。但是本文进行的优良台湾相思树种根瘤菌菌株的筛选工作还是初步的，要筛选出真正能大规模应用于生产的优良菌株仍需进一步的深入研究。

据报道凹，利用外生菌根菌与根瘤菌双接种马占相思，其接种效应优于单接种效应，且外生菌根菌能产生大量孢子，可进行人工纯培养，易于生产中大规模使用，所以该法值得深入研究。同时，VA菌根在促进宿主植物抗逆能力和抗病能力等方面具有优势，也可考虑进行根瘤菌、外生菌根菌和VA菌根三接种效应的研究。由于相思根瘤菌共生体系的固氮过程从根本上是由根瘤菌、相思类树种和立地环境三者共同决定的，因此固氮效率的提高，不应局限于菌株的筛选与改良上，也应挖掘后两者的潜力，如利用遗传工程方法进行相思林木有关性状的基因层次改良，选择具有优良性状的相思类树种，进行精细的耕作管理等等。这是当前摆在我国林业工作者面前的一项紧迫任务，仍需付出长期艰辛的努力。