转基因猪技术及其在农业上的应用

曾　芳，李紫聪，董　锐，吴珍芳，王　翀

(华南农业大学动物科学学院，国家生猪种业工程技术研究中心，广东省农业动物基因组学与分子育种重点实验室，广州 510642)



转基因猪技术及其在农业上的应用

曾芳，李紫聪，董锐，吴珍芳，王翀*

(华南农业大学动物科学学院，国家生猪种业工程技术研究中心，广东省农业动物基因组学与分子育种重点实验室，广州 510642)

摘要：转基因猪技术不仅可用于猪的育种，还可应用于生物医药领域。该技术对养猪业生产水平的提高和人类健康的改善均有重要的应用价值。本文从转基因猪制备所需的显微操作技术和介导外源基因整合方法两方面对转基因猪技术的研究进展进行综述，并简要概括转基因猪技术在农业领域的应用现状。

关键词：猪；转基因；显微注射；基因打靶

猪是重要的经济动物，同时也是现代医学研究常用的大型模式动物。自世界第一例转基因猪问世以来，转基因猪技术发展迅速，在猪品种改良、人类疾病动物模型的建立、异种器官移植供体和药物蛋白生物反应器等方面的研究均取得长足的进展。本文主要介绍显微操作技术和介导外源基因整合方法制备转基因猪的关键技术方面的研究进展，并对转基因猪技术在农业方面的应用进行简要综述。

1转基因猪技术的研究现状

转基因猪制备的效率及操作难度主要由两个方面决定：一方面是制备转基因猪所用的显微操作技术，主要包括原核显微注射(Pronuclear microinjection，PNI)、胞浆注射(Cytoplasmic injection，CI)、体细胞克隆(Somatic cell nuclear transfer，SCNT)、胞浆单精子注射(Intracytoplasmic sperm injection，ICSI)；另一方面是制备转基因猪时用于介导外源基因整合的方法，主要包括普通线性化质粒介导、病毒载体介导、转座系统载体介导以及人工核酸酶介导。人工核酸酶主要包括可对基因进行定点编辑的ZFN(Zinc finger nuclease)、TALEN(Transcription activator-like effecter nucleases)、CRISPR/Cas9(Clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats/Cas9 nuclease)。

1.1用于制备转基因猪的显微操作技术

原核显微注射是制备转基因动物的常用方法。该方法是采用极细的玻璃微量注射针，将外源DNA直接注射到受精卵原核中，再通过胚胎移植技术将含外源DNA的胚胎移植到代孕动物的子宫内发育，从而获得转基因动物。1985年，R.E.Hammer等[1]采用PNI生产出世界上第1头转基因猪。随后三十年，科学家利用原核显微注射法成功生产出各种转基因猪。PNI在转基因猪上应用很成功，但由于PNI操作要求精细、费用高且制备转基因猪的效率较低，通常在1%(转基因猪数/移植的注射胚胎数)左右[2]，其应用受到一定限制。

胞浆注射是指利用微量注射针将DNA直接注射到受精卵胞浆内。猪受精卵含有大量脂肪颗粒，透明度不佳，如进行原核注射通常需对其离心才能看到雄原核。采用胞浆DNA注射法可避免离心对猪受精卵造成的物理损伤，并且胞浆的空间比雄原核要大得多，在操作上较原核显微注射法更简单。2011年，W.Garrels等[3]将含绿色荧光蛋白(GFP)基因的转座子质粒(Sleeping beauty，SB)注射至猪受精卵胞浆生产出转基因猪，证明采用胞浆注射法生产转基因猪的可行性。2013年，本研究团队采用piggyBac(PB)转座系统结合胞浆注射法高效制备出转基因猪，其效率达8.0%(转基因猪数/移植的注射胚胎数)，并通过对比试验优化得到最佳的注射时间、注射剂量等[4]，为进一步采用胞浆注射法制备其他转基因猪提供可用的技术参数。

体细胞核移植也即克隆技术，克隆羊Dolly的出生标志着哺乳动物SCNT的诞生[5]。利用SCNT生产转基因动物的过程是首先将外源DNA转染体外培养的体细胞，然后筛选出转基因体细胞作为核供体，将转基因体细胞核移入去核卵母细胞中再通过胚胎移植获得转基因动物，该方法可确保原代全部是转基因动物，减少转基因动物建系时间，且所需动物数量比原核显微注射法大幅度降低。采用SCNT生产转基因猪的效率仍然较低，其主要原因可能与克隆胚胎通常存在发育缺陷，仅小部分可以存活到出生有关[6-8]。近年来研究人员通过改进卵母细胞的培养体系、激活条件，采用不同猪品种、不同年龄、不同组织来源细胞作为核供体等途径尝试提高SCNT制备转基因猪的效率[9-11]。另外，通常制备多基因整合转基因猪需经过多头转单基因猪相互配种的复杂程序，为简化这一复杂过程，研究人员进行同时转多个基因策略的探索。2011年，W.Deng等[12]利用2A短肽序列将不同的荧光蛋白基因克隆在同一个载体，仅通过一个SCNT操作周期即成功获得含多个转基因的克隆猪，实现多基因的共表达。

胞浆单精子注射法是与精子载体法(Sperm-mediated gene transfer，SMGT)结合起来可用于生产转基因动物的一种显微操作技术，其过程是将与外源DNA共孵育后的单个精子注射到卵母细胞胞浆内，再将其移植到代孕动物子宫使之发育成个体，最终获得转基因动物。2012年，K.Umeyama等[13]采用PNI和ICSI制备获得的转基因猪胚胎中转基因的表达研究，结果发现PNI组仅10%桑椹胚显示转GFP基因阳性，而ICSI组有61.5%桑椹胚显示转GFP基因阳性，且ICSI组出生猪中有25%是转GFP基因猪，表明采用ICSI制备转基因猪的可行性及其可能存在的技术优势。另外，该研究还发现ICSI组转基因大部分呈多拷贝单位点插入，该模式有利于建立稳定表达的转基因动物家系，因此这项研究成果或将促使ICSI成为制备转基因猪的优选技术之一。

1.2用于介导外源基因整合的技术

转基因猪的制备效率不但受所用的显微操作技术影响，还受所用的介导外源基因整合方法的影响。在最早的转基因猪研究中，一般是以线性化的普通质粒为载体介导外源基因整合，具体操作是将携带外源基因的线性化普通质粒注射到受精卵的雄原核，或在体细胞核移植前转染供体细胞。这种介导外源基因整合的方法操作相对简单，但由于外源基因通常仅在宿主基因组DNA发生断裂修复时才能整合到宿主基因组中，因此外源基因整合效率极低，约为10-5～10-6。利用病毒载体介导外源基因整合在宿主基因组的效率比普通线性化载体显著提高，但由于病毒载体可能引起生物安全问题，其应用范围受到极大限制。随着转座子被发现，特别是PB和SB转座子的高转座活性被证明之后，转座系统在哺乳动物上的应用研究受到关注。W.Garrels等[3]和Z.Wu等[14]分别采用SB转座系统和PB转座系统介导基因整合方法高效生产转基因猪。采用SB、PB转座系统制备转基因猪的效率较高，但该技术仍然存在转基因随机整合的缺陷。

近年来，ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9技术的建立，实现了基因的靶向修饰，使转基因技术研究迈向新的台阶。ZFN是由具有特异DNA识别功能的锌指蛋白结构域和具有DNA切割功能的FokI内切酶结构域两部分组成。人们可针对目的基因设计合成相应的ZFN，使其在细胞内靶向切断基因组DNA双链，再通过DNA非同源末端连接修复机制敲除目的基因或DNA同源重组修复机制引入外源基因。F.D.Urnov等[15]首次利用ZFN技术对体外培养细胞进行IL2Rγ基因修复，在未经药物筛选情况下，修复细胞达18%。TALEN除DNA识别结构域与ZFN不同以外，其结构和作用机制均与ZFN相同。TALEN首先特异识别并定位至靶位点，形成二聚体后，在左、右靶位点的中间区域发挥内切酶活性切断DNA双链，从而诱发DNA损伤修复机制使基因敲除或敲入[16]。

CRISPR/Cas9技术是2013年初才发展起来的基因打靶新技术。CRISPR/Cas9由规律成簇间隔短回文重复CRISPR和Cas9核酸酶组成，CRISPR识别特定序列，Cas9核酸酶负责切割。L.Cong等[17]最早利用细菌RNA引导Cas9核酸酶在小鼠和人类细胞基因组的特定基因位点上进行了精确切割。P.Mali等[18]利用CRISPR/Cas9技术，在几种不同的人类细胞中，对AAVS 1位点进行靶向酶切后进行同源重组修复或非同源重组末端连接修复，发现其打靶效率在293T细胞、K562细胞以及诱导性多能干细胞分别为10%～25%、8%～13%、2%～4%，与ZFN、TALEN技术相当。

ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9技术的基因定点修饰特性，近年来用于异种移植的GGTA1基因敲除猪、PARK2和PINK1双基因敲除猪、MHC-Ⅰ基因敲除猪[19-22]陆续被报道。然而，该技术在猪上进行基因敲入研究较少，其可能原因在于基因敲入的实现受更多技术因素制约，如转基因载体的构建，其中包括同源臂的长度、载体的大小等都将直接影响转基因的整合效率，还有转基因插入位点的选择，与转基因最终能否在宿主表达密切相关。因此，从影响基因敲入的各技术因素入手，进行转基因体系的优化，特别是转基因载体的选择、猪基因组上合适插入位点的确定，将有助于这些技术今后在定点修饰转基因猪制备方面的应用。

2转基因猪技术在农业上的应用

2.1生长性能或肉质改良的转基因猪

随着经济增长和生活水平的提高，人们对猪肉量的需求快速增长，对肉品质的要求也大大提高，提高猪的生长性能和肉品质成为猪遗传育种工作者的首要任务之一。转基因育种是实现猪产肉量快速增长和肉品质改善的重要途径。目前涉及该方面的转基因猪研究如表1所列，早期研究多以提高猪肉产量为目的，以生长轴的3大激素：生长激素、类胰岛素生长因子、生长激素释放因子为研究对象生产出各种转基因猪。其中，调控机体生长的核心激素——生长激素是最受关注的，为达到促动物生长的最佳效果，人们在生长激素基因表达的时间和空间上进行研究。随着畜牧业的发展逐渐满足人类对猪肉量的需求，人们转向注重猪肉品质的提升，科学研究也从提高猪肉产量转变为改善猪肉品质。由于猪肉中饱和脂肪酸含量高，摄入过多饱和脂肪酸会引起高血脂、高胆固醇等疾病，相比之下，不饱和脂肪酸更利于健康。K.Saeki等[23]首次生产不饱和脂肪酸比普通猪高约20%的转菠菜脂肪酸脱氢酶基因猪。此后，科学家又研制出转线虫多不饱和脂肪酸脱氢酶基因猪，其中部分转多不饱和脂肪酸脱氢酶基因猪ω-3不饱和脂肪酸含量丰富[24-25]。2.2抗病转基因猪

发展健康养殖业是21世纪国民经济和社会发展的重大战略需求，但猪病频发不仅给养殖业本身带来极大经济损失，由此产生的抗生素药物残留引起的环境污染和食品安全等问题极大地阻碍养殖业的健康发展。培育抗病力强的新品种，从遗传本质上提高猪对疾病病原的免疫力，减少抗生素的使用，对促进养猪业的发展乃至人类健康和环境保护都具有重要的研究意义和应用价值。自20世纪90年代，研究人员就已开始转基因抗病育种研究。如表2所列，抗病转基因研究策略大致可归纳为两种：(1)直接转入抗病基因，如抗粘液病毒基因；(2)基于RNA干扰技术的抗病研究，如转入可抑制病毒复制的小干扰RNA表达质粒。中国作为养猪生产大国，畜牧工作者将猪的抗病育种研究视为工作重点，并在该研究领域获得一定成果。王铁东[33]培育出抗猪瘟病毒的转基因克隆猪；随后，J.Tong等培育出转人溶菌酶基因猪，并证明该转基因猪乳汁中表达的人溶菌酶可抗小猪腹泻[34-35]。Q.Yan等利用体细胞核移植技术制备转猪抗粘液病毒基因的克隆猪，并在体外验证了该转基因猪的耳成纤维细胞比非转基因对照组成纤维细胞具有更好的抗猪瘟病毒能力[36]。

表1生长性能或肉质改良的转基因猪研究现状

Table 1Current research status of transgenic pig for growth and quality improvement

表2抗病转基因猪研究现状

Table 2Current research status of transgenic pig for disease resistance

2.3环保转基因猪

近年来，养殖业引起的环境污染问题已引起全世界的高度关注，其中集约化生产高度集中、养殖量巨大的养猪业是环境污染的主要来源之一。氮、磷是猪粪尿的主要污染物成分，同时也是饲料中重要营养成分，如能提高氮、磷的生物利用率，不但可节约饲料成本，且能明显减少粪尿中氮磷污染物及臭气的排放，减少环境污染。S.P.Golovan等[42-43]首次采用原核显微注法生产了转植酸酶基因猪，该转基因猪在唾液中表达的植酸酶可提高猪对植酸磷的消化率，从而减少猪排泄物中的磷含量。张献伟等[44]培育出共表达葡聚糖酶、木聚糖酶及植酸酶的转基因猪，这些转基因猪对饲料蛋白、磷等营养物质的利用率显著提高，且其排泄物中磷、氮等污染物排放显著减少。Y.S.Lin等[45]研究培育出猪胰腺特异启动子控制的转真菌纤维素酶基因猪，该转基因猪有望提高猪对饲料中纤维素的利用率，减少粪中污染物的排放。

3展望

随着生物技术的不断发展，显微操作技术以及介导基因整合方法的建立与改进，实现了转基因猪的制备。特别是体细胞核移植技术在猪上的成功建立，大大促进转基因猪的研发应用，研究人员利用该技术培育出各种对未来养猪业发展具有重要价值的转基因猪。同时，各种转基因载体体系的改进，特别是转座子等具有介导基因主动整合载体的出现，显著提高转基因在猪基因组上的整合效率。另外，ZFN、TALEN、CRISPR-Cas9基因编辑技术可实现基因的定点修饰，为研究特定基因功能及基因定点改造等提供技术条件。尽管目前还存在基因脱靶等问题，但未来转基因技术的发展目标必将是以实用性和安全性为立足点，建立起高效、安全、简便的转基因猪技术，基因定点编辑技术必将成为转基因技术的核心。此外，转基因猪的生物安全性问题是人们关注的重点，在加强对转基因猪技术的完善和安全评估管理的同时，引导人们对转基因生物的正确认识，才能使转基因技术得以健康发展。

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(编辑程金华)

Transgenic Pig Technology and Its Application in Agriculture

ZENG Fang，LI Zi-cong，DONG Rui，WU Zhen-fang，WANG Chong*

(GuangdongProvincialKeyLaboratoryofAgro-animalGenomicsandMolecularBreeding，NationalEngineeringResearchCenterforBreedingSwineIndustry，CollegeofAnimalScience，SouthChinaAgriculturalUniversity，Guangzhou510642，China)

Key words:pig；transgenesis；microinjection；gene targeting

Abstract:Transgenic pig technology can be used in pig breeding as well as biological medicine.It has valuable application in improving the production level of pig industry and the health of human.Here recent research progresses of transgenic pig technology were summarized by focusing on the micromanipulation technique and the gene integration method which were the keys for transgenic pig production.The current applications of transgenic pig technology in agriculture also were summarized.

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.02.002

收稿日期：2015-06-30

基金项目：广东省自然科学基金博士科研启动项目(2014A030310500); 广东省家畜分子与细胞工程育种技术研究团队项目(2011A020102003)

作者简介：曾芳(1982-)，女，湖南醴陵人，博士后，主要从事动物遗传育种研究，E-mail：zengf8210@163.com *通信作者：王翀，教授，博士生导师，E-mail：betty@scau.edu.cn

中图分类号：S814.8；Q812

文献标志码：A

文章编号:0366-6964(2016)02-0218-07