病料中细菌分离培养方法和抗生素敏感性试验

房莉莉

（黑龙江省动物疫病预防与控制中心，黑龙江哈尔滨150069）

病料中细菌分离培养方法和抗生素敏感性试验

房莉莉

（黑龙江省动物疫病预防与控制中心，黑龙江哈尔滨150069）

1　细菌分离培养的常用方法

细菌分离培养的常用方法有平板划线分离法、加热分离法和实验动物分离法。

1.1平板划线分离法这是目前临床上最常用的分离接种方法。它可以从被检病料中通过划线分离而获得单个菌落，以便挑选可疑菌落作纯培养加以鉴定。具体操作：右手持接种棒，在酒精灯上火焰灭菌；待接种环冷却后，挑取被检料少许，左手持琼脂平板，以食指为支点，用拇指和无名指将平皿揭开一空隙。大约20℃时，迅速地将接种环轻轻地涂布在培养基的边缘。然后，在涂布处来回移动作曲线形划线接种。划线时，以腕力使接种环在琼脂平板表面划动，尽量不要划破培养基，划的线条要密，但不能重复旧线，以免培养物形成菌苔。划线完毕，合上平皿盖，将琼脂平板倒置，放入37℃温箱内培养。

1.2加热分离法此法适用于污染病料中芽孢杆菌或梭菌的分离。先将被检病料接种于一管液体培养基，然后将其置于水浴锅中，加热到80℃，维持20min，杀死病料中非芽孢菌，而带有芽孢的细菌仍可存活。再用接种环取此液于琼脂平板上划线分离，视被检菌的性质做需氧或厌氧培养。如估计液体内带有芽孢的细菌数量少，可先将接种被检病料的液体培养基作增菌培养后，再在平板上划线分离。

1.3实验动物分离法此法适用于污染严重的病理材料。如果用常规的方法，则难以分离到病原菌。具体方法：将被检病料用生理盐水或营养肉汤作1：5～10倍稀释，置于离心机内，按1000转/min的速度离心。取其上清液接种易感实验动物，而污染的细菌则被机体消灭。待动物死亡后，可立即从其心血或病变组织中分离病原菌。

2　细菌对抗生素敏感性试验

测定细菌对抗生素敏感性试验，简称药敏试验。药敏试验对于家禽和特禽细菌性疾病的有效治疗起着关键性的作用。由于各种病原菌对抗菌药物的敏感性不同，即使是同种细菌的不同菌株对同一种药物的敏感性亦有差异。尤其近年来，在兽医临床上广泛使用抗生素，导致耐药性菌株不断出现。如果在临床上盲目地使用抗生素，往往不能达到预期的效果。因此，在临床治疗前，有条件的饲养场应进行药敏试验，以筛选有效的抗菌药物。

细菌对抗生素的敏感性分为高敏、中敏、低敏和耐药4种。高敏和中敏是临床上首选的抗菌药物，而低敏和耐药者一般不能应用。测定药物敏感试验的方法有多种，但临床上普遍应用的是纸片扩散法。

2.1药敏纸片的准备可以使用事先制备的干燥药敏纸片或市售常用的药敏纸片，亦可将灭菌的干燥纸片在临用前浸泡抗菌药液。

2.2琼脂培养基的选择 进行药敏试验的琼脂培养基应选择适合该菌生长的培养基。其配制方法为：取牛肉300g，去脂肪、腱后绞碎，加蒸馏水1000mL，煮沸1h制成肉浸汤。过滤后，补足水量，再加入酪蛋白酸性水解物17.5g、可溶性淀粉1.5g、琼脂17g，加温溶解。调整pH至7.4，于121℃高压蒸汽灭菌15min，在90mm直径的平皿上倾注成4mm厚的琼脂平板。此外，临床上也常用普通营养琼脂平板和麦康凯琼脂平板进行药敏试验。对营养要求较高的细菌，如巴氏杆菌、链球菌等，应选用血平板培养基。

2.3菌液的准备用接种环挑取被检菌纯培养菌落4～5个，接种在4～5mL的肉汤培养基内，置于37℃温箱内培养5～10h。用生理盐水稀释培养液，使其浓度相当于标准浊度管（抑菌圈的大小受菌液浓度的影响较大，因而菌液培养的时间不宜超过17h）。

2.4药敏试验操作方法菌液的接种有划线法和涂布法，即用接种环蘸取菌液，均匀地划线或涂抹在琼脂平板上。待平皿面稍干后，用镊子夹取各种药敏纸片，平放在平板上，并轻压使其贴在平板表面，药敏纸片7张。两纸片中心距离不少于24mm，纸片与平皿边缘不少于15mm。贴好纸片的琼脂平板在37℃温箱内培养18h后观察结果。

2.5结果判定根据药敏纸片周围的抑菌圈大小，测定该菌的抗药程度。因此，必须测量抑菌直径，按其直径报告该菌株对某种药物是高敏、中敏、低敏或耐药。一般直径大于 15mm为高敏，10～15mm为中敏，小于10mm为低敏。

2.6影响药敏试验的因素药敏纸片抑菌圈的大小，往往也受一些因素的作用而影响结果的判定。如菌液的浓度、培养基的厚度，都对抑菌圈的大小产生直接的影响。菌液浓度过大、培养基越厚，纸片周围药物浓度就越低、抑菌圈也就越小。因此，菌液的浓度应相当于标准浊度管，培养基厚度也不能超过4mm。其次，培养基中的pH对某些药物抑菌区影响很大。例如，偏酸时四环素的抑菌圈变大、红霉素的抑菌圈变小，故培养基的pH应为7.2～7.4。此外，琼脂的浓度亦对抑菌圈有影响。琼脂浓度越大，抑菌圈越小。一般琼脂的浓度应为1.5%。除上述因素外，平板盖内的水滴落在琼脂平板上也会影响药敏试验的判定结果。因此，放在冰箱中保存的琼脂平板取出后应放置在37℃温箱中10min，以除去附在平板盖内的水滴，避免各种不良因素影响药敏试验的结果。

10.3969/J.ISSN.1671-6027.2016.09.015