AGT 基因单核苷酸多态性与妊娠高血压易感性的相关性研究

王葭，黄嫦娥（河源市妇幼保健院检验科，广东517000）

AGT 基因单核苷酸多态性与妊娠高血压易感性的相关性研究

王葭，黄嫦娥
（河源市妇幼保健院检验科，广东517000）

目的观察血管紧张素原（AGT）基因单核苷酸多态性（SNPs）与妊娠高血压易感性的关系。方法选取2012年1月至2015年1月河源市妇幼保健院收治并确诊的妊娠高血压患者512例为研究组，对照组为同期在该院的健康体检者502例。应用基因组测序技术，检测AGT基因2个SNP位点（rs5050和rs36218431）基因型。选取rs5050和rs36218431不同基因型妊娠高血压患者外周血血清，采用酶联免疫吸附试验（ELISA法）测定不同基因型患者细胞上清液中AGT浓度。对比分析两组调查对象SNP等位基因频率和AGT浓度。结果两组2个AGT基因SNP位点的基因型分布遵守遗传平衡定律。其中rs5050位点存在GG、GA和AA基因型，研究组仅有rs2006765等位基因G频率（91.0%，919/1 010）显著高于对照组（83.0%，833/1 004），差异有统计学意义（P＜0.05）。rs5050位点GG基因型外周血AGT浓度为（49±3）ng/L，显著高于AA/GA基因型的（31.0±2.5）ng/L，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论AGT基因rs5050多态性与妊娠高血压易感性有显著相关性，其等位基因G是妊娠高血压的易感基因。而两组rs36218431比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。rs5050多态性影响宿主外周血的AGT表达水平，在妊娠高血压过程中起重要作用。

多态性，单核苷酸；高血压，妊娠性；肾素-血管紧张素系统

高血压是一种典型的具有多基因复杂性状疾病，其发生可能与多个基因参与有关，而遗传因素在该疾病的发生过程中扮演着重要角色［1-2］。妊娠期高血压疾病是高血压中一类特殊类型，是孕妇妊娠期所特有的疾病，按临床特点可分为妊娠期高血压、子痫前期、子痫、慢性高血压并发子痫前期及慢性高血压［3-4］。其主要临床特征是在孕妇孕周20周后出现高血压、蛋白尿、水肿或抽搐。临床症状轻者可无症状或轻度头晕，血压轻度升高，可伴水肿或轻度蛋白尿；重者孕妇可表现恶心、呕吐、头痛、眼花、持续性右上腹痛等，血压明显升高，蛋白尿增多，水肿明显，甚至出现昏迷和抽搐［4-5］。本病可严重影响母婴健康，是孕产妇和围生儿发病和死亡的重要原因之一。据相关报道显示，我国孕妇妊娠期高血压的发病率为9.4%，而国外报道为7%～12%。然而其具体病因有多种说法［6-7］。血管紧张素原（AGT）是血管紧张素的前体物质，经肾素作用后产生血管紧张素Ⅰ（AngⅠ）即无活性十肽激素前体，前者在血管紧张素转换酶作用下分解成AngⅡ，后者在机体的肾素-血管紧张素系统（RAS）中发挥着重要作用。其主要作用主要是调

节机体内的血压水平［8-9］。有研究表明，在俄罗斯及日本人种中AGT基因多态性与高血压有相关性［9-11］，但该基因与妊娠高血压易感性的关系尚不十分清楚，有关AGT基因多态性与妊娠高血压易感性的研究鲜有报道。本研究将对AGT基因单核苷酸多态性（SNP）进行了研究，探讨AGT基因多态性与我国汉族人群妊娠高血压发病的关系，分析SNP基因型多态性对外周血中AGT表达的影响。

1　资料与方法

1.1资料

1.1.1一般资料选取2012年1月至2015年1月河源市妇幼保健院收治并确诊的妊娠高血压患者502例为研究组，均为单胎妊娠；年龄19～37岁，平均（26±1.2）岁；所有病例均符合妊娠高血压的诊断标准，并结合病史、临床表现、影像学、实验室检查和病理检查等确诊，且抗高血压治疗结果支持临床诊断［12］。对照组为同时期在该医院的健康体检者502例，其中有生育史472例，无生育史的30例；年龄21～40岁，平均（27.0±1.0）岁。入组标准：无高血压临床表现、无高血压病史、无高血压遗传史。两组研究对象均为汉族，均来自河源地区，无合并其他传染病、慢性病和自身免疫性疾病史。两组一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。所有研究对象均签署知情同意书。

1.1.2试剂和仪器外周血DNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司，聚合酶链反应（PCR）热启动Taq酶购自德泰生物科技（南京）有限公司，AGT酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒购自上海瑞齐生物科技有限公司，琼脂糖凝胶电泳系统购自韩国BIONEER，多功能酶标仪购自宝特科技，96孔梯度PCR仪购自宁波新艺超声设备有限公司。

1.2方法

1.2.1收集标本用肝素锂抗凝管收集参与者的外周静脉血5mL，及时分离血细胞及血浆，血浆冻存于-80℃冰箱，全血用于提取基因组DNA从而进行基因SNP分析。1.2.2提取DNA用外周血DNA提取试剂盒进行DNA提取，提取操作严格按照说明书进行，提取出DNA经验证后置于-80℃冰箱保存为下一步实验备用。提取DNA质量控制方案：取DNA样本1μL，使用超微量分光光度计（美国Agilent公司）测定DNA纯度及浓度，若A260nm/A280nm为1.80～1.85，则认定所提取的DNA纯度合格，否则重新提取DNA。

1.2.3SNP选择从NCBI数据库中选取AGT基因的SNPs标签，选取原则：（1）文献报道中所选基因明确的与疾病有关；（2）上述基因序列经生物信息学分析后有确定的与转录因子结合区的SNP；（3）SNP位于启动子、增强子、5′非编码区域等。共挑选2个AGT基因SNP，分别为rs5050和rs36218431。

1.2.4引物设计采用Primer5软件包进行引物设计扩增或延伸引物。每个选取的SNP位点对应1对PCR扩增引物（均由上海英骏生物技术有限公司合成），引物序列如下rs5050（正向序列）GCAGCAGGGTCAGAAGTG，（反向序列）TGCCAGAAGCGACACTCAC和rs36218431（正向序列）TGGTCTGGCCAAGTGATG，（反向序列）AGAGACAAGACCGAGAAG。

1.2.5SNP测定及分型将DNA样本稀释为500μg/L，使用PCR热启动Taq酶，在96孔板常规扩增，PCR反应所设置的条件：95℃、10min，95℃、10 s，58℃、30 s，72℃、30 s，共40个循环，最终72℃延伸5min。PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳进行确认后收集产物提供给测序公司进行测序处理。将测序公司所获得的数据进行分析。

1.2.6AGT浓度检测选取30例妊娠高血压患者rs2006765不同基因型外周血，分离出血清并在96孔板上每孔接种50μL血清，在体外使用双抗体夹心方法，应用ELISA试剂盒测定AGT浓度，严格按照说明书进行操作。

1.3统计学处理应用SPSS 13.0统计软件进行数据分析，对SNPs位点基因型进行Hardy-Weiberg平衡检验，计数资料以率或构成比表示，采用χ2检验；计量资料以±s表示，采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1AGT基因SNP位点基因型分布（1）rs5050：研究组505例患者中GG基因型433例，GA基因型53例，AA基因型19例；对照组502例参与者中GG基因型387例，GA基因型59例，AA基因型56例。（2）rs36218431：研究组505例患者中GG基因型402例，GA基因型59例，AA基因型44例；对照组502例参与者中GG基因型403例，GA基因型57例，AA基因型42例。

2.2ATGSNP位点等位基因频率与妊娠高血压易感性的关系经Hardy-Weinberg遗传平衡检验后，研究组和对照组AGT基因2个SNP位点的基因型分布均遵守遗传平衡定律，两组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。在2个SNP位点中。仅rs2006765等位基因G频率在病例组（91.0%，919/1 010）高于对照组（83.0%，833/1 004），差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.3rs5050基因多态性对AGT分泌水平的影响研究组rs5050的GG基因型外周血中AGT分泌水平为（49±3）ng/L，显著高于AA+GA基因型的（31.0±2.5）n/L，差异有统计学意义（P＜0.05）。

3　讨论

妊娠高血压是妊娠期妇女所特有的疾病之一，其特征性的临床病理特征就是在孕周20周后出现血压升高伴蛋白尿。虽然以往有很多的研究对该病进行过一系列研究，但迄今为止其病因仍不是很明确。流行病学资料显示妊娠高血压与基因遗传有密切关系，大量的研究数据表明遗传性因素在各种疾病的发生、发展过程中发挥着重要作用，妊娠高血压也不例外［3-5］。随着该病相关的遗传易感基因研究的不断展开，已发现有一批相关的基因SNPs与妊娠高血压病易感性存在明显相关性［13-14］。本研究将围绕着AGT单核苷酸多态性与妊娠高血压之间的关系进行相关研究，试图阐明AGT单核苷酸多态性在妊娠高血压中的作用。

尽管妊娠高血压的具体病因还不清楚，但越来越多的证据表明RAS系统在妊娠高血压中发挥着重要作用［9-10］。而AGT是RAS系统中重要的一类分子，AGT是肾素作用的前底物。在血液循环中，其被肾素水解生成无活性的AngⅠ，后者在血管紧张素转化酶（ACE）作用下转化成AngⅡ。RAS系统主要通过Ansll发挥收缩血管、增加心输出量、促进血压升高［10］。本研究采用病例对照研究方法，探讨AGTSNPs在妊娠期高血压中的作用，为有针对性地做好孕前及孕期保健、提高监测和干预效果、减少妊娠期高血压的发生风险提供科学依据。从本研究的数据来看，AGT中的rs5050位点存在GG、GA和AA 3种基因型，其中研究组等位基因G频率（91.0%，919/1 010）显著高于对照组（83.0%，833/1 004），差异有统计学意义（P＜0.05）。这一数据表明AGT在妊娠高血压这一病例过程中有可能发挥着潜在的作用。本研究根据AGT是RAS系统中重要的一员这一特性，检测不同基因型患者血清中的AGT水平看是否与之有关系。本研究结果显示rs5050位点GG基因型外周血AGT浓度为（49±3）ng/L，显著高于AA/GA基因型的（31.0± 2.5）ng/L，差异有统计学意义（P＜0．05）。提示AGT基因rs5050多态性与妊娠高血压易感性有显著相关性，其等位基因G是妊娠高血压的易感基因。rs5050多态性影响宿主外周血的AGT表达水平，在妊娠高血压过程中起重要作用。而两组另一位点rs36218431比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

总之，AGT作为RAS系统中重要的一员，其在妊娠高血压发展中有着重要作用，而从基因水平出发检测该基因在rs5050的多态性后发现，GG型有助于妊娠高血压的发展，其可能是通过影响AGT在外周血中的表达水平发挥重要作用。这为临床更好地了解AGT在妊娠高血压中的作用提供了新的观点，同时也为临床提供潜在的治疗靶点。

［1］KocyigitY，Atamer Y，Atamer A，etal.Changes in serumlevelsof leptin，cytokines and lipoprotein in pre-eclamptic and normotensivepregnant women［J］.Gynecol Endocrinol，2004，19（5）：267-273.

［2］Redman CW，Sargent IL.Latestadvances inunderstandingpreeclampsia［J］. Science，2005，308（5724）：1592-1594.

［3］赵伟，王建华.妊娠高血压综合征的筛检及相关危险因素的研究［J］.中华流行病学杂志，2004，25（10）：845-847.

［4］蒋迪仙.妊高征流行病学调查［J］.实用妇产科杂志，1991，7（3）：119-120.

［5］林其德.子痫前期子痫病因及发病机制的研究进展［J］.中国实用妇科与产科杂志，2004，20（10）：577-579.

［6］石永云，凌斌.妊娠高血压疾病病因学研究进展［J］.国外医学：计划生育/生殖健康分册，2006，25（4）：200-202.

［7］王清德.妊娠高血压综合征发病机制的探讨——肾素-血管紧张素-醛固酮系统及前列环素-血栓素与妊娠高血压综合征关系的研究［D］.北京：中国协和医科大学，1995.

［8］Zhu M，Zhang J，Nie S，et al.Association of ACE I/D，AGTM235 gene polymorphismswith pregnancy induced hypertension in Chinese population：ameta-analysis［J］.JAssistReportGenet，2012，29（9）：921-932.

［9］朱铭伟，夏燕萍，程蔚蔚，等.胎儿血管紧张素转换酶基因多态性与妊高征发病的关系［J］.中华妇产科杂志，1998，33（10）：622-623.

［10］江美琼，傅芬.血管紧张素系统相关基因多态性与妊娠期高血压疾病的相关性研究［J］.实用临床医学：江西，2008，9（5）：25-28.

［11］Mohajertehran F，Tavakkol Afshari J，Rezaieyazdi Z，etal.Association of singlenucleotide polymorphisms in thehuman tumor necrosisfactor-alpha and interleukin 1-beta genes in patientswith pre-eclampsia［J］.Iran JAllergy Asthma Immunol，2012，11（3）：224-229.

［12］Brown MA，Lindheimer MD，de SwietM，et al.The classification and diagnosisof the hypertensive disordersof pregnancy：statement from the International Society for the Study of Hypertension in Pregnancy（ISSHP）［J］. Hypertens Pregnancy，2001，20（1）：Ⅸ-ⅩⅣ.

［13］Khan KS，Wojdyla D，Say L，et al.WHO analysis of causes ofmaternal death：a systematic review［J］.Lancet，2006，367（9516）：1066-1074.

［14］Liang J，Zhu J，Dai L，etal.Maternalmortality in China，1996-2005［J］. Int JGynaecolObstet，2005，110（2）：93-96.

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.08.037

B

1009-5519（2016）08-1220-03

（2015-12-20）