正电子发射断层显像与质谱成像互补结合寻找肿瘤相关分子标志物初探

吴培琳++贺玖明　李铁刚　党永红　再帕尔·阿不力孜　朱朝晖

[摘 要] 正电子发射断层（PET）显像可以活体、无创反映疾病的特征分子改变，如利用18氟-脱氧葡萄糖（18F-FDG）反映肿瘤的葡萄糖代谢，以及利用18氟-硝基咪唑（18F-FMISO）反映肿瘤的乏氧状态等。质谱成像（MSI）不需要标记和复杂准备，可以离体检测到成百上千种分子在病灶内的精确分布信息，但这些分子的功能往往不易明确。本研究利用BALB/c裸鼠4T1乳腺癌肿瘤模型，将PET显像和电喷雾MSI结合，通过图像对比和统计软件分析，分别找到了与PET糖代谢图像和乏氧图像匹配的系列分子，通过查找人类代谢组数据库，初步确定了这些分子的组成。基于以上，本研究初步证实了PET显像和质谱成像互补结合寻找特征分子标志物的可行性。

[关键词] 正电子发射断层；质谱成像；18氟-脱氧葡萄糖；18氟-硝基咪唑；分子标志物

中图分类号：R445.6 文献标识码：A 文章编号：2095-5200（2016）01-001-05

尽管肿瘤是由变异的肿瘤细胞经过不断单克隆分裂增殖生成的，但是肿瘤内部并不均匀，存在异质性。实体肿瘤血管网络发育和分布畸形造成了微环境的差异，使得氧分压以及细胞外酸度值呈梯度分布[1]。肿瘤细胞经过多次分裂增殖后，其子细胞呈现出分子生物学或基因方面改变，从而使肿瘤内细胞的生长速度、侵袭能力、对药物的敏感性、预后等各方面产生差异。研究与这些特征相关的分子改变具有重要意义。

质谱成像（mass spectrometry imaging，MSI）是将质谱的离子扫描技术与成像处理软件相结合的一种新型成像方法，具有不需要标记、无复杂的样品前处理、可以一次提供大量分子的空间分布信息等优点。近年来，MSI技术越来越多地受到人们关注，成为成像研究领域的一个新热点[2]。目前，迫切需要解析质谱成像所展示的丰富分子信息，确定其相关功能。

正电子发射断层显像（positron emission tomography，PET）是一种先进的分子影像方法，在功能、代谢、受体显示等方面具有明显的优势[3-4]。例如，可以利用18氟-脱氧葡萄糖（18F-fluorodeoxyglucose， 18F-FDG）为示踪剂揭示肿瘤各部分的葡萄糖代谢情况，以及用18氟-硝基咪唑（18F-fluoromisonidazole， 18F-FMISO）来显示肿瘤各部分的乏氧状态等。这一技术可以直观、准确地显示疾病相关的分子改变，并生成图像。不足之处是必须引入外源标记化合物，且一次只能分析一种或有限的几种功能分子改变。

每一种功能的改变，往往不是一种或几种分子就可以实现，而是一系列分子改变共同组合的结果。利用分子机制已知的经典PET技术，有可能帮助刚刚起步、可能具有广泛应用前景的MSI技术，阐明与某一功能改变相关的系列分子改变，例如找出更多的与肿瘤糖代谢或乏氧相关的分子等。

本研究拟将PET与MSI两种分子影像方法互补结合，希望建立寻找肿瘤标志物的新方法，帮助解决临床诊断和治疗难题。

1 实验材料与仪器

小鼠4T1乳腺癌细胞（中国医学科学院北京协和医学院基础医学研究所），用改良RPMI1640完全培养基培养；6周龄雌性BALB/c裸小鼠，体重18～20 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司[SCXK（京） 2012-0001]，在北京协和医院动物中心无特定病原体（specific-pathogen free，SPF） 的饲养间[SYXK （京） 2010-0028]饲养。使用Siemens Inveon microPET仪进行图像采集，其工作站配备专用图像采集软件和图像分析软件。18F-FDG和18F-FMISO均由本单位自行生产合成，放射化学纯度>98%。动物麻醉使用美国Summit公司AS-1-000-7型异氟烷气体麻醉系统，吸入麻醉剂为异氟烷（山东科源）。

肿瘤标本按一定方位用冰冻切片机（Leica CM 3050）切成8μm，置于防脱载玻片（Thermo，Superfrost plus），-80℃冰箱保存。质谱仪采用 Q-Exactive型台式四极杆-轨道阱高分辨质谱仪 （Thermo Scientific），配有Xcalibur 2.2 数据处理系统，安装自制的AFAI 离子源（中国医学科学院北京协和医学院药物研究所天然药物活性物质与功能国家重点实验室），及特别编制的质谱成像分析处理软件1.0（清华大学精密仪器与机械学系精密测试技术及仪器国家重点实验室）。

2 实验方法

实验流程见图1。

2.1 肿瘤模型的建立

细胞培养用含10%胎牛血清、100IU/mL青霉素和100μg/mL链霉素的改良RPMI1640培养基作为4T1细胞培养液，于5% CO2、37℃细胞培养箱内常规培养。收集处于生长对数期的细胞，分别稀释至细胞数量1×108个/mL。取0.1mL 细胞悬液接种于BALB/c小鼠右侧腋窝下，制作小鼠移植瘤乳腺癌模型，共接种8只。分别在接种的第1、3、5、7、9、11、13天连续观察肿瘤的生长情况。

2.2 4T1乳腺癌移植瘤裸鼠microPET显像及图像分析

观察肿瘤直径达到9 mm左右时，连续两天进行18F-FDG和18F-FMISO显像。两次显像间隔时间大于20h。图像采集时间设定为10 min，同位素选择18F，其余参数选择系统默认。数据重建用二维有序子集最大期望值法（OSEM2D），其余重建参数选择系统默认。采集完成后，在弹出对话框内输入放射性药物的剂量和测量时间等，由系统自动完成重建。

2.3 取材并将肿瘤组织切成冰冻切片

荷瘤裸鼠进行两次显像后，立刻将其处死取肿瘤，肿瘤剥离动物体时标记部位和方向，以便于后期两种成像方式图像的对比。取出的肿瘤组织用锡纸包裹后放入液氮以保证肿瘤组织内的各代谢成分保持不变。最后转移至-80℃冰箱保存。切冰冻切片前，将肿瘤组织从-80℃冰箱转移至冷冻切片机内复温，冷冻切片机操作温度为-20℃。用水将组织固定在冰冻标本盘上。连续获取相邻5个厚度为8μm的肿瘤组织切片，分别置于5张防脱载玻片上，并对切片方向进行标记。置于-80℃冰箱保存。

2.4 乳腺癌肿瘤组织质谱成像分析与标志物的筛选

乳腺癌肿瘤组织冰冻切片，干燥器中真空干燥约30 min后用于质谱成像分析。AFAI-MSI 成像分析参数：喷雾气流速60arb，喷雾电压9 000 V，喷雾溶剂组成为甲醇：水 = 90：10（V/V，含0.1%甲酸），抽气流速为45 L/min，传输管电压 3 000 V。原始数据导入质谱成像软件1.0中，在质谱图选取某一特定质核比的离子，代入质谱成像软件中，使其与PET图像相一致。在此质谱成像图上选取高分布区的5个像素点数据，同时在低分布区选取5个像素点数据。8个标本用同样方法共选取80个像素点数据。将这80个像素点的数据做离散度分析，并作模型可信度分析，经过统计分析选出影响因子大于6且经过t检验P<0.001的质核比的离子作为差异离子，最终代入质谱成像软件进行验证并与PET图像进行对比验证。选出的差异离子经过数据库（HMDB，http：//www.hmdb.ca/）检索找出相应的潜在标志物。

3 实验结果

3.1 肿瘤中不同区域的葡萄糖代谢和乏氧状态不同

PET图像分析发现，同一肿瘤中18F-FDG和18F-FMISO的摄取有明显的分布差异。如图2所示6只荷乳腺癌小鼠模型中，多数情况下，靠近身体或肢体的肿瘤组织18F-FDG摄取较高，而远隔的肿瘤组织摄取相对较低，提示不同区域对葡萄糖的需求不同；而同一肿瘤中18F-FMISO的分布多位于18F-FDG摄取相对较低，但又没有完全坏死缺失区域，提示相应区域的肿瘤细胞处于高度乏氧状态。

3.2 初步筛选出与糖代谢相关的分子以及与乏氧相关的分子

对比两种成像方法的图像，初步筛选出与糖代谢高度相关分子的质荷比（m/z）为： 744.4949，744.4996， 770.5126，771.5129，771.5178，772.5248，798.5399， 799.5522，800.5499，813.5249，822.5476，825.5591。经过查找HMDB，这些质核比所对应的分子分别是：磷脂酰胆碱（PC） （30：0） /磷脂酰乙醇胺 （PE）（33：0）， 胆碱（CL）（72：7）， PC（32：1），磷脂酰甘油（PG）（34：1），PG（36：4），PC（32：0），PC（34：1），PG （38：4），PE（40：5）/PC（34：0），CL（84：15），PC（36：3），PG（40：5）。与乏氧高度相关的分子的质核比为：780.5510，804.5531，830.5648，832.5769，832.5874。经过查找HMDB，这些质核比所对应的分子分别是：PC（34：2），PC（38：7），PC（38：5），PC（38：4），PC（40：7）。图3示例了18F-FDG PET图像和筛选出的质谱成像图像的比较，以及18F-FMISO PET图像与匹配的质谱成像图像的比较。

4 讨论

Zanzonico等分析了同一肿瘤内部18F-FDG和18F-FMISO放射性摄取分布，发现二者有显著差异，认为与肿瘤的异质性有关，并由两种显像剂不同的显像原理所致[5]。18F-FDG与葡萄糖结构相近，通过细胞膜上的葡萄糖转运体（glucose transporters， GLUTs）转运至细胞内，在己糖激酶作用下生成18F-6-磷酸-FDG，之后便不能进一步代谢，从而滞留于细胞内，积聚数量的多少反映了肿瘤组织对葡萄糖需求的高低。本研究发现，靠近身体一侧的肿瘤组织往往18F-FDG摄取较高，这是由于这一侧的肿瘤更容易从身体获得血液供应，因此营养充足，肿瘤活性较高，对葡萄糖的需求量也更大。而位于肿瘤中心部位及远离身体的肿瘤组织，由于血供不足，缺乏用于细胞增殖的原料、能量和氧，因此糖代谢活性相对低，对18F-FDG摄取也比较少，特别是肿瘤中心部位，往往在肿瘤超过5mm后出现坏死，表现为放射性缺失[6]。

18F-FMISO可通过弥散作用进入细胞内，在细胞内黄嘌呤氧化酶作用下，其硝基发生单电子还原，产生自由基阴离子。在正常细胞中，由于氧化硝基具有更高的电子亲和力，自由基阴离子被迅速氧化成原化合物，重新扩散回细胞外。当缺乏足够的氧时，自由基阴离子被进一步还原，产物与细胞内组分结合，滞留于细胞内[7]。因此，18F-FMISO的摄取与氧分压有很好相关性，主要浓集于供氧不足但又没有完全坏死的区域，这与本研究观察到的18F-FMISO多位于18F-FDG摄取相对较低但又没有完全缺失的区域相一致。

由于Warburg效应，肿瘤细胞即使在氧供充足时，也以无氧糖酵解途径供能。如果肿瘤组织血供充足，主要通过HIF-1途径转换至乏氧模式，表达包括GLUTs在内的相关分子，增强葡萄糖的摄取和糖酵解过程；如果肿瘤组织血供明显不足，超出代偿范围，组织的乏氧进一步增强HIF-1活性，使肿瘤细胞表达VEGF和COX2等分子，并增强肿瘤的侵袭、转移和对放化疗的抵抗能力[8]。深入研究相关分子改变有助于进一步理解肿瘤的发生、发展机制，以及寻找相关的分子标志物，为临床分子诊断及靶向治疗提供依据。

20世纪90年代末，代谢组学继基因组学、蛋白质组学之后逐渐兴起[9]，包括脂质代谢组学、糖类代谢组学、毒素代谢组学等[10]。其中，脂质代谢组学作为重要的代谢组学分支，逐渐成为研究的热点[11]。

近年来，研究脂质代谢组学的方法和技术也取得了突破性进展，如薄层色谱法、气相色谱-质谱联用法、电喷雾电离质谱法、基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱法等[12]。随着分子影像兴起，以各种质谱技术为基础的成像方法也不断发展。Chughtai等人检测到在MDA-MB-231乳腺癌供氧丰富的区域分布有质荷比为772.5的分子并用MS/MS质谱分析法验证了质荷比为772.5的结构是PC（32：0）[13]，Seiji Ishikawa等人研究发现在甲状腺乳头状癌中质荷比为772.5的分子含量低于正常甲状腺组织。同时他们也发现质荷比为798.5的分子在甲状腺癌含量增高，并证实了其为PC（34：1） [14]。另外，一项有关腺淋巴瘤内PC分布的研究报道了在腺淋巴瘤区域，质荷比为772.5和822.5的分子具有高丰度，并通过串联质谱法验证了这些分子分别为PC（32：0）， PC（36：3）[15]。以上研究是将病理的方法与质谱成像结合，找出肿瘤与非肿瘤区域的分子分布差异，是组织水平与分子水平的对比。本研究则探索了将活体的PET显像和离体的质谱成像两种分子影像方法结合起来，选出了一批与糖酵解和乏氧相关的脂质分子，其中以上报道的PC（32：0）、PC（34：1） 和PC（36：3）赫然在列，与肿瘤的糖代谢增高相关，此外还发现另外9种与糖代谢高度相关及5种与乏氧高度相关分子。以上初步证明，基于PET显像寻找和分析MSI中肿瘤相关分子标志物是合理可行的。