C-Kit+心脏干细胞在心肌修复中的作用

龚剑萍　综述　刘剑　审校

(重庆医科大学附属第一医院心血管内科，重庆400016)



C-Kit+心脏干细胞在心肌修复中的作用

龚剑萍综述刘剑审校

(重庆医科大学附属第一医院心血管内科，重庆400016)

【摘要】终末期冠心病是因大量心肌细胞丧失功能而致不可逆转性损害，以心力衰竭为主要表现的临床综合征。自发现C-Kit+心脏干细胞可分化为心肌细胞后，移植C-Kit+心脏干细胞促进心肌的修复便成为基础和临床研究的热点之一。尽管还有诸多问题尚待解决，但这为终末期心肌修复的研究带来新的方向。现就C-Kit受体及配体、C-Kit+心脏干细胞及其在心肌修复中的作用、局限性做一综述。

【关键词】C-Kit受体 ； 心脏干细胞； 心肌修复

冠心病是一类因冠状动脉粥样硬化，使血管腔狭窄或阻塞，和因冠状动脉功能性改变(痉挛)，导致心肌缺血缺氧坏死而引起的心脏病,以心绞痛和心肌梗死最为常见,严重危害人类健康，位居中国致死疾病的前三位。目前临床常见的用于治疗冠心病的方法包括：药物治疗、介入治疗、冠状动脉旁路移植手术等，但均无法逆转心肌缺血缺氧这一病理过程。

自2003年心脏干细胞被报道以来，相关的研究迅速成为热点。根据表面标志物，心脏干细胞可分为C-Kit+细胞、Scal-1+细胞等几种类型。C-Kit+心脏干细胞可定向分化为心肌细胞、内皮细胞和平滑肌细胞，提示其在冠心病治疗中修复缺血缺氧心肌的巨大潜能。大量的相关实验证据表明，心肌细胞具有可再生性，这为临床上使用C-Kit+心脏干细胞治疗心脏病、修复心肌提供新思路。

1C-Kit受体

C-Kit受体是由位于4q11-12染色体上的C-Kit基因(在哺乳动物细胞内发现的12-15Kb大小的一段保守序列)编码，约含975个氨基酸、分子量109kD(≈10.9×104)的一类在多能干细胞表面表达的Ⅲ型跨膜蛋白酪氨酸激酶受体蛋白，又称干细胞因子(stem cell factor,SCF)受体、肥大细胞因子受体，也即CD117。C-Kit受体由膜外区、跨膜区和胞内区3部分组成。其中，膜外区由cDNA的1-9号外显子编码表达的5个免疫球蛋白区域组成，D1-D3区域为C-Kit受体在配体驱动下与配体发生二聚体化形成复合物的关键部位，D4、D5区域则影响复合物之间的通讯。C-Kit受体与配体形成复合物后，内源性酪氨酸激酶被激活，受体发生自身酪氨酸残基磷酸化，导致细胞内结构域形成一个信号复合物，而磷酸化的酪氨酸部位又可作为新的结合位点，激活1020种不同的细胞内信号蛋白，再次形成新的胞内复合物后，激活信号传导通路下游的各种蛋白靶分子的级联放大反应，从而产生一系列生物学效应[1]。

C-Kit受体与配体结合后，可通过多条信号通路和串道反应，以及诸多旁分泌或自分泌过程,影响心脏干细胞的迁移、增殖、分化，参与心肌修复。其中，最为重要的有PI3K通路、JAK-STAT通路、P38MAPK通路、Smads通路、Ras-Erk通路、SFK通路、磷酯酶Cγ通路等。如下所述：(1)基质细胞衍生因子-1α(stromal cell-derived factor,SDF-1α)或趋化因子受体-4(chemoking receptor-4,CXCR4)信号轴，可上调C-Kit受体在心脏干细胞上的表达，同时可激活MAPKp42 /44-ELK-1、PI3K/PLC-γ-AK/FAK/NF-кB 、JAK-STAT等多条下游途径，促进 C-Kit+心脏干细胞迁移至病变心肌。当使用抑制剂AMD3100 和 LY294002抑制SDF-1α并减少CXCR4的表达后，C-Kit+心脏干细胞的迁移可被抑制，从另一方面证实了C-Kit+心脏干细胞的迁移、归巢是存在的，具体机制不清楚[1-3]。(2)当C-Kit+心脏干细胞迁移至病灶后，C-Kit受体可与相关细胞因子或物质结合如骨形态发生蛋白，激活Smads和P38MARK两条通路并促进通路间的串道反应，作用于细胞核内转录途径中的辅助因子或转录因子，刺激基因表达，促进心脏干细胞分化为心肌细胞[4-7]。(3)体外培养的C-Kit+心脏干细胞可分化为心肌细胞和血管，为心肌再生作用提供事实依据[8]。(4)体外诱导人心脏干细胞表达C-Kit受体后再进行培养，发现C-Kit+心脏干细胞不仅可分化为功能性心肌细胞，还可分化为血管内皮细胞和平滑肌细胞，促进心肌修复[9]。

2C-Kit受体的配体SCF

SCF是C-Kit受体发挥其生物学功能最为重要的配体。SCF最初是在鼠类身上发现的，由10号染色体上Sl基因编码，含有220个氨基酸，在哺乳动物中具有高度同源性。而人SCF是由12q22-24基因编码的包含信号肽、胞外区和胞浆区三部分的糖蛋白。其中，胞外区是两个SCF单体的相互作用形成二聚体的区域，由4个反向平行的螺旋束折叠形成的短链构成。而在每个SCF单体的尾部，有一疏水性的裂缝和带电荷的区域，是与C-Kit受体形成复合体的重要部位。SCF与C-Kit受体形成复合体后，可促使酪氨酸激酶自磷酸化并募集信号蛋白质，促进底物磷酸化，激活多条下游信号通路。

SCF与C-Kit受体形成二聚体复合物后，可通过激活多条信号通路或旁分泌作用，如通过P38MARK信号通路介导心肌干细胞和自然杀伤细胞的活化，在心肌梗死后心肌修复过程中起到促进C-Kit+心脏干细胞迁移、增殖和分化，动员血管形成和强化免疫防御的作用，从而促进心脏功能的恢复。早前的研究显示，在心肌病变部位的SCF表达(包括相关蛋白及mRNA水平)和心脏干细胞数量呈同比升高，若同时干扰SCF与C-Kit受体的二聚化或使用选择性抑制剂如SB203580抑制SCF与心脏干细胞数量同比升高这一效应，可影响心脏干细胞的迁移数量[10]。将SCF基因导入小鼠心肌梗死模型中，发现SCF局部浓度可较对照组明显增高，而高浓度的SCF与促进心肌干细胞迁移至梗死灶、心脏干细胞增殖及分化，减少瘢痕纤维化及梗死灶面积，改善心功能和愈合密切相关[11]，从基因层面进一步证实SCF可促进心肌修复。上述研究证实，SCF介导了C-Kit+心脏干细胞的活化、迁移和心肌修复过程。

3C-Kit+心脏干细胞

传统观念认为, 心脏是终末分化的器官而心肌细胞是一种终末分化的细胞。但是，研究人员从心脏中发现并分离出来一定数量的心脏干细胞，是一类具有分化为心肌细胞、平滑肌细胞和内皮细胞潜能的、具备增殖能力的、定位于心脏的干细胞或在特殊微环境下迁徙至心脏的多潜能干细胞。根据细胞表面标志物的不同，可将心脏干细胞分为不同的类型。其中，细胞表面标志物C-Kit受体表达阳性的心脏干细胞(C-Kit+心脏干细胞)是心脏组织中最主要的心脏干细胞，在修复损伤心肌中起重要作用。C-Kit+心脏干细胞主要有以下三类[12]。

Lin-/C-Kit+心脏干细胞，是由Beltrami等在成年大鼠心脏组织中发现并分离出来的定植于心肌组织中数量最多的一类C-Kit+心脏干细胞，104个心肌细胞中大约有1个，成簇状位于高分化的心肌细胞与活化的原始细胞之间的基质中，主要分布在心尖、心房和心室基中部区域，7%～10%可表达早期心肌转录因子GATA4、Nkx2.5和MEF2而不表达其他特异性蛋白，在大鼠、猪、狗等的心肌组织中无特异性[13]。Lin-/C-Kit+心脏干细胞可以自我克隆、增殖并分化为心肌细胞、血管内皮细胞和平滑肌细胞, 体内和体外生物学行为无明显差异，在心脏的生理与病理过程中均有表达。动物实验表明，在心肌梗死后冠状动脉内或心肌内注射Lin-/C-Kit+心脏干细胞，发现其在梗死区域均有表达增多，且能抑制左心室重构、改善心功能，为慢性缺血性心脏病的远期治疗带来新的希望[14-16]。而SCIPIO I期临床实验也证实, 移植Lin-/C-Kit+心脏干细胞到心肌梗死后的患者体内可缩小梗死面积并改善心功能[17]。

心肌球样细胞 (cardiosphere cells, CDCs)是从心房和心室中分离出来、在体外培养形成多种心脏干细胞成簇聚集的细胞团(“心肌球”)并传代扩增得到的单层干细胞，称为CDCs干细胞，当表达C-Kit受体时即为C-Kit+CDCs。C-Kit+CDCs具有明显的自我更新、克隆和多向分化的潜能，能分化为心肌细胞、血管内皮细胞和平滑肌细胞[18]。动物实验表明，在心肌梗死后冠状动脉内或心肌内注射C-Kit+CDCs，可促进心肌细胞再生、减少梗死灶、改善心功能[19-21]。而SCIPIO I期临床实验也得到类似结果，证实移植C-Kit+CDCs可促进心肌细胞再生、减小心肌梗死灶瘢痕面积并增加左室射血分数[17]。

Nkx2.5+细胞是近几年从小鼠胚胎的心脏组织中分离出的一类干细胞，目前的研究暂未得到其准确的分布。当Lin-/C-Kit+心脏干细胞和C-Kit+CDCs表达Nkx2.5+时，即Nkx2.5+干细胞[18, 22]。大多数Nkx2.5+干细胞可分化为心肌细胞和传导系统细胞，甚至平滑肌细胞，以干预传导系统为其特点，但具体的细胞生物学功能还在进一步研究中。

以上三种是迄今为止发现的表达干细胞表面标志物C-Kit受体的几类干细胞，均可分化为心肌细胞、血管内皮细胞和平滑肌细胞，前两者有明确的改善心功能作用，尤其在心肌梗死的修复研究中显示出明确的效果，但其具体的起源及分化方式目前尚存有争议。

4C-Kit+心脏干细胞在心肌修复中的作用

自发现C-Kit+心脏干细胞为定植于心肌中数量最多的一类干细胞，并可分化为心肌细胞、血管内皮细胞和平滑肌细胞，具有明确的改善心功能作用以来，国内外诸多动物试验及临床研究依此展开，有望在心肌修复治疗方面体现其强大的优势并为临床治疗提供新的手段。

在动物试验中，研究人员建立了小鼠急性和慢性心肌梗死后心力衰竭的动物模型，并将C-Kit+心脏干细胞移植到梗死区，发现C-Kit+心脏干细胞可与配体结合，级联激活多条信号通路、刺激旁分泌作用，促进C-Kit+心脏干细胞分化为心肌细胞、血管内皮细胞及平滑肌细胞。实验组可观察到小鼠心肌细胞代偿性肥大减轻、毛细血管密度增加、心肌梗死面积缩小、心功能得到明显改善[23-24]。在猪、犬心肌梗死模型上，将C-Kit+心脏干细胞注射到心肌梗死区域或心肌梗死后冠状动脉内，均证实实验组心室重构明显延缓，左心室功能明显改善[24]。

一项针对移植C-Kit+心脏干细胞治疗心肌梗死后心功能不全患者的Ⅰ期临床试验(SCIPIO)取得积极结果，证实C-Kit+心脏干细胞可促进心肌再生。该试验选取射血分数40%并拟行冠状动脉搭桥手术的患者，术中从患者心脏右心耳部分分离出心脏组织，在体外获得C-Kit+心脏干细胞并进行扩增。术后4个月，将扩增的C-Kit+心脏干细胞注射入20例患者的冠状动脉内，而13例对照组患者不处理。4个月后，试验组左心室射血功能从(27.5±1.2)% 增加到(35.1±2.4)%，1年后增加到(41.2±4.5)%，而对照组没有明显变化。同时，磁共振成像显示，试验组心肌梗死面积明显缩小[17, 25]。而在另一项随机I期临床研究(CADUCEUS试验)中，双中心随机选取心肌梗死后左心室功能不全患者，由心内膜活检收集组织培养C-Kit+心脏干细胞， 17例为实验组，8例为对照组，6个月后磁共振成像检查显示实验组心肌梗死瘢痕减少，存活心肌、局部收缩力、室壁厚度显著增加[26]。这些早期临床证据在一定层面上证实了C-Kit+心脏干细胞的心肌再生潜能及其短期应用的有效性和安全性。

5C-Kit+心脏干细胞在心肌修复中的局限性

目前的研究展现了C-Kit+心脏干细胞应用于心肌修复的广阔前景。但在C-Kit+心脏干细胞的移植实验中观察到，随着时间的推移，心肌内的干细胞数量成大比例的下降，可能是心肌梗死后炎性细胞和细胞因子激活、营养物质缺乏等促进移植细胞发生程序性细胞死亡所致[16]，而其生物学功能的维持考虑与激活的旁分泌作用相关。此外，有研究人员在体外孵育C-Kit心脏干细胞及心肌梗死后修复实验中，未能得出C-Kit+心脏干细胞分化为心肌细胞的结论[27-29]，结合临床SCIPIO试验本身的自限性，仍需客观看待C-Kit+心脏干细胞在心肌修复中的局限性。

C-Kit+心脏干细胞在心肌修复中的作用的局限性主要表现在以下几个方面：(1)自体心肌组织中分离提取出C-Kit+心脏干细胞后，虽没有移植时免疫排斥的困扰，但较难成功培养和扩增，而异源细胞则存在移植后的免疫排斥反应；(2)目前常用的细胞移植方法有：直接的心内外膜下注射、静脉注射、冠状动脉注射或经主动脉直接输入等，但任何一种方式都可观察到C-Kit+心脏干细胞严重流失的现象，不能排除心脏功能的改善与C-Kit+心脏干细胞激发的旁分泌作用相关；(3)移植到心脏中的C-Kit+心脏干细胞增殖、分化与微环境密切相关，临床研究分化成功与否还需结合个体差异后进一步研究；(4)目前的研究历时较短，暂未有前瞻性的研究证实其安全可靠，对于C-Kit+心脏干细胞用于心肌修复的远期不良反应仍需警惕[30]。

6结语与展望

随着近年来对干细胞研究的深入，研究人员成功发现C-Kit原癌基因的表达产物C-Kit受体，并定义了C-Kit+表型干细胞，这些都成为研究C-Kit+心脏干细胞治疗心肌梗死，并促进受损的心肌细胞修复、改善心脏重构这一过程的理论基础。本文通过讨论C-Kit受体在心脏干细胞上的表达，以及C-Kit对于心脏干细胞迁移、增殖和分化的影响，并结合多项临床研究，可初步证实心脏干细胞修复心肌梗死患者的心肌和降低病死率的作用[16]。但是，还有许多需要进一步探索的问题，如心脏干细胞来源的选择、移植心脏干细胞的最佳时机与方式、心脏干细胞迁徙组织区域的限定、心脏干细胞移植修复心肌的远期疗效等。或可利用现在飞速发展的纳米医学和再生医学技术，如构建纳米支架为心脏干细胞的生长提供依附，促进体外扩增细胞成活率；利用生物电喷镀和空气动力学技术减少心脏干细胞的注射位点的流失；结合缓释技术局部放大心脏干细胞治疗的潜在功效等。这些新方法、新技术的使用，使得大家对C-Kit+心脏干细胞广泛应用于临床心肌修复的前景充满信心。

[ 参 考 文 献 ]

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Action of C-Kit+Cardiac Stem Cells in Myocardial Repairment

GONG Jianping,LIU Jian

(DepartmentofCardiology,TheFirstAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China)

【Abstract】End-stage coronary heart disease is caused by the loss of function of myocardial cells in large quantities resulting in direct irreversible damage and manifested into heart failure. As C-Kit+cardiac stem cells(C-Kit+CSCs) have been reported to differentiate into myocardial cells,the basic and clinical research has focused on transplanting C-Kit+CSCs to the myocardial lesions to promote the repair of myocardial cell. Although many problems remain unsolved, this focus has developed a new direction in the research of cardiac treatment. In this paper, we reviewed the C-Kit receptor and its ligand, C-Kit+CSCs and their actions in myocardial repair as well as relevant limitations.

【Key words】C-Kit receptor;Cardiac stem cells;Myocardial repairment

收稿日期：2015-06-11修回日期：2015-09-24

【中图分类号】R542.2

【文献标志码】A【DOI】10.16806/j.cnki.issn.1004-3934.2016.01.016

作者简介：龚剑萍(1991—)，硕士,主要从事心肌再生方面研究。Email：490213514@qq.com通信作者：刘剑(1966—)，副主任医师,主要从事动脉粥样硬化方面研究。Email：liujian819@126.com