快速振荡法高效提取小鼠腹腔巨噬细胞研究

徐尤年，刘桂林，蒙 臣，张诗海

·论著·

快速振荡法高效提取小鼠腹腔巨噬细胞研究

徐尤年，刘桂林，蒙 臣，张诗海

【摘要】目的通过与传统的腹腔巨噬细胞提取方法——轻揉法进行比较，建立一种高效提取小鼠腹腔巨噬细胞体外分离培养的方法——快速振荡法。方法2014年11月选取雄性健康SPF级C57bl/6小鼠20只，采用随机数字表法分为轻揉组和振荡组，各10只。分别采用传统的腹部轻揉法和快速振荡法提取小鼠腹腔巨噬细胞。流式细胞仪检测巨噬细胞凋亡率，计算细胞总数及巨噬细胞总数。结果两组小鼠体质量和腹腔灌洗液回收率比较，差异无统计学意义(P>0.05)。轻揉组巨噬细胞凋亡率为(5.44±0.08)%，振荡组巨噬细胞凋亡率为(5.60±0.12)%，差异无统计学意义(t=1.09，P=0.29)。振荡组细胞总数〔(5.69±0.23)×106与(3.82±0.12)×106〕和巨噬细胞总数〔(2.64±0.08)×106与(1.66±0.07)×106〕均多于轻揉组(P<0.05)。结论快速振荡法提取小鼠腹腔巨噬细胞，巨噬细胞凋亡率无增加，细胞总数及巨噬细胞总数明显增加，是一种更加高效的提取腹腔巨噬细胞的方法。

巨噬细胞是机体重要的免疫细胞，体内分布广泛，在抗感染、抗肿瘤和免疫调节中起着非常重要的作用[1-2]，也是研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象。与传代细胞相比，原代细胞与体内组织更接近，形态结构和功能活动更相似[3]，因此备受科研工作者们关注。但如何从这些组织器官中分离、纯化获得高纯度、高活性的巨噬细胞，选择适当的细胞提取方法是体外细胞培养研究工作者的首要任务。本实验以小鼠腹腔巨噬细胞为研究对象，建立一种高效提取小鼠腹腔巨噬细胞体外分离培养的方法——快速振荡法。

1材料与方法

1.1主要试剂与仪器含3%胎牛血清的磷酸盐缓冲液(PBS)，Annexin V-异硫氰酸荧光素(FITC)/ 碘化丙啶(PI)细胞凋亡检测试剂盒(BioLegend公司)，抗小鼠FITC-F4/80流式抗体(BioLegend 公司)，1 ml移液器，5 ml注射器，显微镜(Olympus SZ51，日本)，离心机(测维光电TG16A-WS，上海)，流式细胞仪(BD influxTM，美国)。

1.2实验动物2014年11月选取雄性健康SPF级C57bl/6小鼠20只，8周龄，体质量20～24 g，由武汉大学实验动物中心提供。

1.3小鼠腹腔巨噬细胞分离、检测将小鼠摘眼球放血后以颈椎脱臼法处死，采用70%乙醇溶液消毒小鼠腹部皮肤，然后让其呈仰卧位四肢展开，固定于解剖板上，无菌条件下打开小鼠腹腔，用眼科镊提起下腹皮肤，剪一小口，并沿腹中线剪开3～5 cm长的腹部皮肤，上至颈部，充分暴露腹膜。取5 ml注射器，向腹腔注射4 ml PBS和1 ml空气。注意进针勿过深，不要损伤内脏及血管。采用随机数字表法将小鼠分为两组。轻揉组10只：采用5 ml注射器吸取腹腔内4 ml的PBS，轻揉腹部2 min，静置5 min后用注射器刺入腹腔，吸取腹腔灌洗液。然后用镊子提起腹膜，在腹膜上剪一小口，再用1 ml移液器取PBS 1 ml重复灌洗2次。将3次回收的腹腔灌洗液置于离心管。振荡组10只：用5 ml注射器吸取4 ml PBS和1 ml空气注入腹腔，右手拿起解剖板，快速水平振荡2 min(约100次)，用注射器刺入腹腔，吸取腹腔灌洗液。然后用镊子提起腹膜，在腹膜上剪一小口，再用1 ml移液器取PBS 1 ml重复灌洗2次。将3次回收的腹腔灌洗液置于离心管。计算腹腔灌洗液回收率：记录每只小鼠3次腹腔灌洗液的总体积，除以总量3 ml。

本研究创新点：

作为一种免疫细胞，巨噬细胞在病原微生物清除、炎性反应、肿瘤发生发展中扮演重要角色，也是研究细胞免疫和分子免疫学的重要对象。但如何提取高纯度的原代巨噬细胞进行科学实验是困扰研究者们的一个难题，轻揉法是提取原代巨噬细胞最常用的方法。根据巨噬细胞易黏附、贴壁的特点，本研究提出振荡法这一新的提取巨噬细胞的方法，跟传统的轻揉法进行对比发现，振荡法可以获取更多的巨噬细胞，从而为科研工作者获取原代巨噬细胞提供新的方法。

1.4细胞凋亡分析参照流式细胞仪试剂盒操作规范，4 ℃，300×g离心5 min，收集5×105个细胞，重悬细胞后，加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI，轻轻混匀，避光、室温反应10 min。样品在1 h内采用流式细胞仪检测巨噬细胞凋亡率。

1.5细胞计数4 ℃，400×g离心6 min，所得细胞沉淀用PBS重悬，充分混匀后用血球计数板计数并计算细胞总数。

1.6巨噬细胞分类计数参照本课题组前期的方法[4]进行巨噬细胞流式标记检测。腹腔灌洗细胞(1×106个) 悬液100 μl中，加入抗小鼠 FITC-F4/80抗体0.5 μl，室温避光作用 40 min，用2 ml PBS 混匀，400×g离心5 min，弃去上清液，加入200 μl PBS，采用流式细胞仪测定细胞总数和巨噬细胞总数。

2结果

2.1两组小鼠体质量和腹腔灌洗液回收率比较两组小鼠体质量和腹腔灌洗液回收率比较，差异无统计学意义(P>0.05，见表1)。

Table 1Comparison of body mass and the recovery rate of peritoneal lavage fluids between the two groups

组别只数体质量(g)灌洗液回收率(%)轻揉组1022.1±0.582.89±1.13振荡组1022.5±0.583.19±0.96t值0.130.20P值0.930.64

2.2两组巨噬细胞凋亡率比较轻揉组巨噬细胞凋亡率为(5.44±0.08)%，振荡组巨噬细胞凋亡率为(5.60±0.12)%，差异无统计学意义(t=1.09，P=0.29，见图1)。

2.3两组细胞总数和巨噬细胞总数比较轻揉组细胞总数为(3.82±0.12)×106，振荡组细胞总数为(5.69±0.23)×106，差异有统计学意义(t=7.39，P<0.001)。轻揉组巨噬细胞总数为(1.66±0.07)×106，振荡组巨噬细胞总数为(2.64±0.08)×106，差异有统计学意义(t=9.56，P<0.001，见图2)。

3讨论

本课题组在提取腹腔巨噬细胞时发现，巨噬细胞贴壁性很强，参照传统的轻揉法[5-6]提取的腹腔细胞数量少，巨噬细胞比例低，并且需要静置5～7 min，甚至更长时间。本课题组经过反复实验，对传统方法进行了改进，提出快速振荡法，提高了巨噬细胞的提取率，提取的巨噬细胞活力与传统的方法相似，缩短了实验时间，方便了实验的进行。

注：FITC=异硫氰酸荧光素，PI=碘化丙啶

图1Annexin V-FITC/PI流式细胞仪检测巨噬细胞凋亡率

Figure 1Apoptosis rate of macrophages apoptosis detected by Annexin V-FITC/PI FCM

图2　两组小鼠分离细胞

目前，腹腔巨噬细胞可以直接提取，也可以先在腹腔注入巨噬细胞刺激剂(如肉汤、淀粉、蛋白胨等)[7-8]，诱导巨噬细胞进入腹腔，从而提高巨噬细胞的获取数量。虽然此法能收集到大量的腹腔巨噬细胞，但获得的腹腔巨噬细胞与原体内巨噬细胞相比，功能基础已经发生了一定程度的变化，因此与这种方法相比，直接提取方法避免了注入的大分子物质对巨噬细胞功能的影响[6，9]。传统的直接提取巨噬细胞的方法就是轻揉法[6，10]。

本研究根据巨噬细胞特点提出快速振荡法，与传统的轻揉法相比，快速振荡法提取的腹腔细胞总数和巨噬细胞总数更多。其原因可能是：(1)轻揉法局部刺激了肠道，增加了成纤维细胞和淋巴细胞的比例。(2)快速振荡法增大了对腹腔内细胞的冲刷作用，促使巨噬细胞游离，因此可以获取更多的巨噬细胞。(3)在应用快速振荡法时腹腔内有1 ml的空气，增加了液体移动空间，同时减少了腹腔灌洗液的外渗和细胞的丢失，有利于提高液体回收率和细胞数。本实验中，快速振荡法与轻揉法比较，腹腔灌洗液回收率无差异，因为轻揉法提取腹腔巨噬细胞的动作轻柔，腹腔灌洗液回收率已经比较高，腹腔灌洗后部分液体滞留在腹腔脏器间隙，难以完全回收。快速振荡法中，1 ml空气对快速振荡法的成功使用至关重要，如果未注入1 ml空气，快速振荡时压力的快速变化会导致腹腔灌洗液的外渗，降低腹腔灌洗液回收率和细胞数。同时本研究发现，两组巨噬细胞凋亡率相似，说明快速振荡法并未对提取细胞的存活产生影响。

快速振荡法提取腹腔巨噬细胞的过程中，需要特别注意几点：(1)颈椎脱臼法处死小鼠之前先摘眼球放血，减少提取的细胞中红细胞的比例，减少红细胞对巨噬细胞的刺激活化，有利于巨噬细胞基础功能的保持和后续实验研究。(2)腹腔灌洗时用4 ml PBS和1 ml空气注入腹腔，空气进入腹腔后在最上面，减少振荡过程中腹腔内的液体从注射针孔外溢，提高腹腔灌洗液回收率和细胞数。(3)用注射器或者是枪头在腹腔吸取腹腔灌洗液时避免对腹腔内脏器的过度刺激(不要将大小肠吸入移液器枪头)，减少腹腔灌洗液中的成纤维细胞(成纤维细胞也是贴壁细胞，后续实验中贴壁洗涤纯化得到巨噬细胞时无法将成纤维细胞去除，只能去除淋巴细胞和红细胞)。(4)灌洗液中加入3%胎牛血清，或者是直接用RPMI 1640培养基灌洗，一方面可以提高巨噬细胞的提取数量，另一方面可提供营养物质，维持细胞活性。

针对巨噬细胞贴壁性强的特点，本课题组通过反复实验对巨噬细胞提取方法进行改进，提出快速振荡法。该方法简单易行，缩短了实验时间(轻揉法要求按摩腹部5 min甚至更长，导致腹腔脏器水肿，腹腔灌洗液回收率低)，极大提高了腹腔巨噬细胞的获取率，方便了科研工作者对巨噬细胞功能的研究。

作者贡献：徐尤年设计、收集、分析数据撰写完成，并对文章负责；刘桂林、蒙臣辅助；张诗海指导并负责实验质量控制和文章审校。

本文无利益冲突。

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(本文编辑：陈素芳)

【关键词】巨噬细胞；小鼠；细胞分离

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Highly Effective Extraction of Mouse Peritoneal Macrophages by Quick Vibrating MethodXUYou-nian,LIUGui-lin,MENGChen,etal.DepartmentofAnesthesiology,UnionHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430032,China

【Abstract】ObjectiveTo establish a high-efficiency method to obtain mouse peritoneal macrophages for separation and cultivation in vitro,which is quick vibrating method,by comparison with the traditional method,which is soft kneading method.MethodsIn November 2014,20 male healthy C57bl/6 rats of SPF grade were collected,and random number table method was employed to divide the rats into soft kneading group and rapid oscillation group,with 10 rats in each group.Traditional abdomen soft kneading method and quick vibrating method were employed to extract mouse peritoneal macrophages.FCM was used to detect the apoptosis rate of peritoneal macrophages,and the total number of cells and peritoneal macrophages were calculated.ResultsThe two groups were not significantly different in the body mass and the recovery rate of peritoneal lavage fluids (P>0.05).The apoptosis rate of peritoneal macrophages of soft kneading group was (5.44±0.08)%,and that of rapid oscillation group was (5.60±0.12)%,without significant differences between the two groups.The rapid oscillation group was higher than the soft kneading group in the total number of cells〔(5.69±0.23)×106vs.(3.82±0.12)×106〕 and peritoneal macrophages 〔(2.64±0.08)×106vs.(1.66±0.07)×106〕 (P<0.05).ConclusionThe extraction of peritoneal macrophages by the quick vibrating method cause no increase of the apoptosis rate of peritoneal macrophages and marked increase of the total number of cells and peritoneal macrophages.Therefore,it is a more effective method of peritoneal macrophages extraction.

【Key words】Macrophages；Mice；Cell separation

(收稿日期：2015-08-11；修回日期：2015-12-09)

【中图分类号】R 446.5

【文献标识码】A

doi：10.3969/j.issn.1007-9572.2016.03.013

通信作者：徐尤年，430032 湖北省武汉市，华中科技大学同济医学院附属协和医院麻醉科；E-mail：xyn0103@126.com

基金项目：国家自然科学基金青年基金资助项目(81201454)
作者单位：430032 湖北省武汉市，华中科技大学同济医学院附属协和医院麻醉科