抗菌肽的分离纯化研究进展
2016-02-19袁慧坤袁文华刁新平
袁慧坤 袁文华 刁新平
（东北农业大学动物科技学院，黑龙江 哈尔滨 150030）
抗菌肽的分离纯化研究进展
袁慧坤 袁文华 刁新平
（东北农业大学动物科技学院，黑龙江 哈尔滨 150030）
抗菌肽是抗生素的替代选择之一，具有较高的抗菌活性和与抗生素不同的作用机制，不易产生耐药性。但是，天然抗菌肽的提取存在成本高、操作繁琐等缺点，因此需要加强对新型抗菌肽的研究。本文主要对天然抗菌肽的优势、分离和纯化步骤进行综述。
抗菌肽；分离纯化；结构测定
自1972-1975年从果蝇及惜古比天蚕中分离出天蚕素（Cecropin）以来，抗菌肽便受到广泛的关注。抗菌肽（Antimicrobial Peptide）又被称为肽抗生素（Peptide Antibiotics）。抗菌肽的来源广泛，大多数生物体的自然防御系统内均含有抗菌肽。抗菌肽对于已经产生抗生素耐药性的细菌具有有效的抑制作用，不易产生耐药性，所以抗菌肽成为具有极大研究潜力的物质。
1 抗菌肽的抗菌优势
抗菌肽拥有的与传统型抗生素不同的抗菌机制，使得抗菌肽具有抗细菌、抗病毒、抗寄生虫等病原体活性高和靶向点多、耐药性低等优势。抗菌肽的肽链长度相对较短，一般为15～50个氨基酸残基构成，其分子量小，更易于快速到达感染部位。另外，抗菌肽可以不同功能类型联合使用或与抗生素互相联合发挥其协同效应，增强机体免疫能力。
2 抗菌肽的分离纯化与结构测定
分离纯化是天然抗菌肽获取过程中的一项重要环节，是进一步对抗菌肽的人工合成与机理研究的基础步骤。分离纯化的过程复杂，对于未知成分和结构复杂的抗菌肽，其难度更大。分离纯化的关键在于既要保持抗菌肽的生物活性，又要得到纯的单一活性的肽。所以，在分离纯化阶段每操作一步都要对其抗菌活性进行检测，只有具备抗菌活性，才有必要进行接下来的试验，从而得到理想的单一活性肽。
2.1 纯化前处理
在分离纯化步骤前，要注意对样品的前处理：若抗菌肽存在于体积偏大的有机体内的组织或器官，应在提取前将其按照不同组织或器官分类；若抗菌肽存在于机体偏小至难分割状态时，要使整个机体作为提取的对象。同时，要注意对干燥温度、储藏时间等因素的调控，以防对试验结果产生影响。
2.2 分离纯化
2.2.1 分离纯化的步骤。抗菌肽的分离纯化基本都是根据抗菌肽的两亲性、带正电荷和分子量小的特性进行。另外，抗菌肽的纯度与上样量和层析柱等均有关系。目前的分离纯化步骤可归纳为以下3步［1］：①使用高速离心或者超滤的方法除去样品中的大分子蛋白质、脂肪和颗粒物；②使用分子筛、固相萃取、离子交换色谱等方法去除部分较大分子蛋白质、无机盐和脂肪等干扰物，进一步分离提取得到分子量比之更小的成分；③将滤液通过阳离子交换层析、反相高效液相色谱法（RP-HPLC）分离纯化活性物质。
2.2.2 分离纯化的方法。抗菌肽的分离纯化方法主要有：依据溶解性能差别分离，可将其分为低温有机溶剂沉淀、盐析法等；根据分子大小的不同分离，可将其分为超滤、透析和凝胶过滤等；根据配体特异性分离，如亲和层析法［2］等。研究表明，大部分的分离纯化是根据多肽类的理化性质而采用多级纯化方法和多种分离方法结合使用。陈玉清等［3］通过Sephadex G-100凝胶过滤层析和CM-Sepharose CL-6G离子交换层析及HPLC分离，在家蚕幼虫免疫血淋巴内分离出2种抗菌蛋白。
2.3 抗菌肽结构测定方法
2.3.1 非质谱技术。如今，N端测序法是应用于氨基酸序列的主要测定方法。虽然N端测序法已被广泛应用于氨基酸测序中，但存在一个弊端，就是位于N端的多肽或蛋白质无法被测定。此时，可以使用脱修饰反应，使得N端的氨基酸序列暴露出来进行测定。而且，Edman降解是N端测定法的基础，较小的肽段是无法被Edman讲解法测定出全序列的。所以，其灵敏度较低，不适合应用于高通量分析中。
2.3.2 质谱技术。近年来，质谱技术飞速发展，针对分子量相对较小的蛋白开发出了4种测定技术：电喷雾、离子体解吸、基质辅助激光解吸／电离和快原子轰击。而纳升电喷雾-四极杆-飞行时间串联质谱技术的出现，使得测定微量蛋白质的领域得到巨大提升。电喷雾质谱测度的原理是肽段通过与惰性气体不断碰撞，诱导分裂而衍生出的一系列碎片离子，通过他们的质量差推断所需测定的氨基酸序列。纳升电喷雾串联质谱就是安装一系列纳升喷雾源在四极杆-飞行时间串联质谱（Q-TOF2）上，该方法的优点是可以使翻译后的氨基酸纯度及修饰不能够制约抗菌肽的序列测定。使离子阱电喷雾串联质谱或三四级电喷雾串联质谱与其比较可知，四级杆-飞行时间电喷雾串联质谱（QTOF-ESI-Ms/Ms）的灵敏度和分辨率要高一些，质量测定的准确度同样较高。所以，四级杆-飞行时间电喷雾串联质谱更佳适用于抗菌肽的测序，更有益于获得准确度高的数据。
质谱软电离技术在进行蛋白质测定时，所产生分子相对稳定，方法有效，因此受到众多领域的重视，不仅在蛋白质序列测定上，还在有机化学、药学和高分子化学上发挥巨大潜力，成为众多研究学者分析分子纯度、质量的有效工具。
3 展望
天然抗菌肽针对致病菌的入侵和免疫功能的调节均有显著功效，并且其广谱抗细菌、无免疫源性和分子量小等功效均有待开发，其毒副作用等无明确阐述，仍需要不断优化抗菌肽的分离提纯等技术，不断加深对抗菌肽的研究和探索。
抗菌肽在农业、食品、医药方面表现出很大的潜力价值，但若是将其投入畜牧业，开始大规模生产仍存在很多待解决的问题，如从自然物质中提取抗菌肽是一个相对来讲比较复杂的过程，来源受限，分离纯化步骤繁琐，投入高是回报率低。所以，想要让抗菌肽更广泛地应用于各个领域，仍需要进一步研究其副作用、相互作用及各个环节。
［1］苗建银，柯畅，郭浩贤，等.抗菌肽的提取分离及抑菌机理研究进展［J］.现代食品科技，2014（13）：203-240.
［2］韩金玉，那平，元英进.亲和色谱纯化蛋白质新进展［J］.色谱，1996（6）：447.
［3］陈玉清，李保存，吴希，等.家蚕抗菌蛋白Cecropin D和Lysozyme的分离纯化及性质鉴定［J］.南京师大学报（自然科学版），2006（3）：103-107.
TS201.2
A
1674-7909（2016）36-43-2
袁慧坤（1993-），女，硕士，研究方向：动物营养与饲料科学。
刁新平，副教授，硕士生导师。
