我国BHK-21细胞悬浮培养生产口蹄疫疫苗的进展

2016-02-18佛生福令世鑫王家敏马忠仁乔自林

西北民族大学学报（自然科学版） 2016年2期

关键词：口蹄疫反应器培养基

佛生福,马　祺,王　丹,令世鑫,王家敏,马忠仁,乔自林

(1.西北民族大学甘肃省动物细胞工程技术研究中心，甘肃兰州 730030；2.兰州百灵生物技术有限公司，甘肃兰州 730010)

我国BHK-21细胞悬浮培养生产口蹄疫疫苗的进展

佛生福1,马祺2,王丹2,令世鑫1,王家敏1,马忠仁1,乔自林1

(1.西北民族大学甘肃省动物细胞工程技术研究中心，甘肃兰州 730030；2.兰州百灵生物技术有限公司，甘肃兰州 730010)

口蹄疫疫苗生产中应用BHK-21细胞悬浮培养技术比转瓶贴壁培养在产量和质量上均有优势，该技术也已全面应用于我国口蹄疫疫苗生产中.悬浮培养技术中悬浮细胞株的驯化，个性化培养基开发和生物反应器高密度培养工艺是疫苗生产工艺的关键因素，也是未来研究的主要方向.

BHK-21细胞；悬浮培养；口蹄疫疫苗

0　前言

BHK-21细胞即叙利亚仓鼠肾细胞(Baby Hamster Kidney cell，BHK-21或BHK21)于1961年由Macpherson IA、Stoker MGP建系，源自5只未辨性别的1日龄仓鼠肾，该细胞广泛用于增殖病毒生产疫苗.原始的BHK-21细胞株为贴壁生长型细胞，驯化成悬浮培养型细胞系可进行病毒大规模增殖，在提高疫苗产量的同时由于生物反应器无血清培养工艺的应用提高了疫苗的产量和质量.1965年Capstick等[1]在不锈钢发酵罐中用驯化的悬浮培养型BHK-21 细胞培养生产了口蹄疫疫苗，开启了BHK-21细胞悬浮培养应用的新篇章，此后该细胞悬浮培养技术在多个领域得到了广泛应用.本世纪初，我国科研人员对BHK-21细胞的悬浮培养技术进行了深入研究，经过十几年的探索和改进，其研究成果在口蹄疫疫苗生产中已广泛应用，为我国控制该疾病的发生和传播起到至关重要的作用.

1　悬浮培养技术的优势

传统的口蹄疫疫苗生产工艺是用含血清(通常是牛血清)的细胞培养液将贴壁培养型细胞经多次传代扩大培养到一定数量后接种相应的病毒再培养后制成，生产规模受细胞生长贴附面积的限制而放大困难，工艺的生产周期长、劳动强度大、产品质量不稳定批间差大，而且在培养中使用了血清，存在污染外源病毒和致病因子的风险，残留的牛血清也会引起接种动物的副反应.新型口蹄疫疫苗生产工艺使用生物反应器将细胞完全悬浮于培养液中生长，细胞培养规模与培养容器的体积相关，容易实现线性放大，而且在生产过程中无血清培养基的使用消除了因使用牛血清而带来的安全风险.2009年金宇保灵[2]在国内率先使用BHK-21细胞悬浮培养技术生产口蹄疫疫苗，之后天康生物、中农威特和中牧股份等具有口蹄疫灭活疫苗生产资质的企业也相继进行了悬浮培养的工艺改造，国内口蹄疫灭活疫苗在短短几年内全部实现了生物反应器悬浮培养工艺.在悬浮培养工艺中细胞驯化、个性化培养基开发和生物反应器培养工艺是关键技术环节.

2　细胞驯化

原始的BHK-21细胞为贴壁型培养株，培养过程中需添加动物血清才能正常生长，经驯化可实现全悬浮和无血清培养，我国口蹄疫疫苗生产企业所用的悬浮型细胞株各不相同.薛英等[3]用胰酶消化贴壁型BHK-21细胞后在MEM中添加8%和20%新生牛血清直接在生物反应器中100r/m培养驯化，24 h细胞倍增可达到2～3倍.李荣等[4]用驯化的低血清悬浮细胞在生物反应器中培养至2×106/mL后接种口蹄疫病毒再培养20～30 h时细胞密度可达4×106/mL.井莲娜等[5]通过低血清贴壁、低血清悬浮和无血清悬浮三个阶段驯化了适应无血清全悬浮培养的BHK-21细胞，驯化的细胞在无血清培养基密度可达4.5×106/mL以上，细胞活力在90%以上，倍增时间为18 h.冯玉萍等[6]依次使用MEM、DMEM/F12和无血清培养基适应培养，血清浓度也从10%逐步降至无血清的方法驯化了BHK-21全悬浮培养型细胞，在低血清和无血清培养时细胞密度可达5×106/mL以上，该细胞株在多家口蹄疫疫苗企业生产中使用.

3　个性化培养基

细胞培养基是细胞体外培养的重要因素.在大规模培养技术中，细胞培养基对细胞高密度生长、增殖和维持至关重要，尤其是细胞经过无血清悬浮驯化后对培养基的要求更高，一株悬浮细胞往往需要开发个性化无血清培养基才能正常生长.不同细胞株的营养代谢特征不同，培养工艺也不同，抗剪切力和培养规模的放大、病毒表达量的提高，这些均需要个性化培养基的支持.2008年北京清大天一研发了BHK-21细胞低血清培养基应用到金宇保灵的生产中，细胞密度可达4×106/mL，2009年该公司推出了无血清和无动物成分来源BHK-21细胞个性化培养基[7].2010年安芳兰等[8]在GMEM的基础上研究确定了本单位的BHK-21悬浮型细胞对葡萄糖、谷胺酰胺和丙酮酸钠的最佳添加量为3 mM、3 mM和1.5 mM.同年，令世鑫等[9]在DMEM/F12的基础上添加了氨基酸、维生素、微量元素和细胞生长因子及表面活性剂开发了BHK-21细胞的个性化无血清培养基，使BHK-21悬浮细胞在生物反应器中培养密度达5×106/mL以上.

4　培养工艺

随着疫苗生产规模不断扩大和技术水平的提高，传统的转瓶培养模式已不能满足生产的需求，生物反应器培养技术的应用适应了工业化大规模细胞培养的客观需求.2009年金宇保灵采用1 200 L生物反应器生产口蹄疫灭活是当时国内BHK-21细胞悬浮培养体积最大的生物反应器[7].2010年新疆天康也建立了1200L生物反应器生产线，此后中农威特、中牧股份、上海海丽和上海申联等口蹄疫疫苗生产企业相继建设培养体积更大的生物反应器生产线，设计的细胞培养罐培养体积超过了5 000 L.2010年刘学荣[10]等研究了乳酸对BHK-21细胞悬浮生长的影响.结果表明，在乳酸浓度小于9.4 mM时对细胞生长有促进作用，9.4～23.5 mM对细胞生长有弱抑制作用，大于42.3 mM对细胞有强抑制作用.2011年武发菊等[11]研究了氨对BHK-21悬浮细胞生长代谢的影响，结果表明，在乳酸浓度小于1.8 mmol/L时对细胞生长没有抑制，2.5～8 mmol/L时有弱抑制，15 mmol/L时细胞开始死亡.2011年乔自林等[12]通过流加培养方式确定了BHK-21悬浮型细胞从一支细胞冻存管中复苏开始到5 L→120 L→650 L反应器的放大工艺，使细胞在反应器的密度在5.0×106/mL，活力在94%以上.2013年付智财等[13]研究了悬浮培养型BHK-21细胞的生长规律和不同接种密度培养效果的研究，确定悬浮细胞4×105～6×105/mL接种培养能达到较高培养密度，细胞生长快，且细胞峰值持续时间长.同年武发菊等[14]研究了BHK-21悬浮细胞起始密度在3×105～9×105/mL时从48 h开始流加富含氨基酸、维生素、微量元素和次黄嘌呤及无血清培养基添加成分的浓缩液，细胞密度都可达到7.4×106/mL.

5　结语

我国BHK-21细胞悬浮培养技术已广泛应用于口蹄疫疫苗的大规模生产中，驯化高产悬浮细胞株，设计能更好地支持悬浮培养的个性化培养基以及优化生物反应器高密度培养工艺是未来研究的主要方向.

[1] Capstick P B,Garland A J,Chapman W G．Production of foot-and-mouth disease virus antigen from BHK21 clone 13 cells grown and infected in deep suspension cultures [J].Nature,1965,205(976):1135-1136.

[2] 农业部.农业部公告第1184号新兽药注册目录(EB/OL),2009.4.2.

[3] 薛英,王延,王玉红等.BHK-21细胞的悬浮驯化及其在悬培条件下对口蹄疫A型病毒的培养[J].广东畜牧兽医科技,2008,01:35-37.

[4] 李荣,周劲松,刘国英等.口蹄疫疫苗的悬浮培养工艺研究[J].中国兽药杂志,2011,45(7):14-16.

[5] 井莲娜,付智财,黄炯.无血清培养基悬浮培养BHK21细胞驯化的研究[J].草食家畜,2013,03:51-56.

[6] 冯玉萍,乔自林,令世鑫等.一种在低血清和无血清培养基中高密度悬浮培养的BHK-21细胞及其制备方法[P].中国：ZL201110050597,2014年10月8日.

[7] 张韧,王建超,陈文庆等.反应器细胞悬浮培养和微载体培养技术在动物疫苗生产中的应用[J].中国兽药杂志,2012,11:39-43.

[8] 安芳兰,刘学荣,武发菊等.BHK21悬浮细胞培养基中能量物质的优化[C].第三届兽医大会—兽医生物制品学、兽医微生物学学术论坛论文集,2010,163-165.

[9] 令世鑫,马忠仁,李明生等.一种BHK-21细胞全悬浮培养的无血清培养基[P].中国:ZL201310546756.1,2015年9月2日.

[10] 刘学荣,武发菊,安芳兰等.不同浓度的乳酸对BHK-21细胞生长代谢的影响[J]. 第三届兽医大会—兽医生物制品学、兽医微生物学学术论坛论文集(2010年)：319-324.

[11] 武发菊,尚勇良,安芳兰等.氨对悬浮培养幼仓鼠肾细胞_BHK_21_生长代谢的影响[J].西北农林科技大学学报(自然科学版), 2011,39(2):28-32.

[12] 乔自林,令世鑫,李明生等.BHK-21细胞无血清悬浮培养技术在蹄疫疫生产中的应用[P].中国:ZL20111066205.6,2013年6月12日.

[13] 付智财,王家敏，令世鑫等.悬浮培养型BHK-21细胞的生长规律和不同接种密度培养效果的研究[J].西北民族大学学报(自然科学版),2013,34(3):43-46.