壮药了刁竹质量控制方法的研究▲

陆峥琳 黄瑞松 黄 琴 梁晓东 叶积秀

(1 广西民族医药研究院民族药研究所，南宁市 530001，E-mail：499146468@qq.com；广西医科大学2 药学院，3 基础医学院，南宁市 530021；4 广西中医药大学药学院，南宁市 530001)

论著·桂药研究

壮药了刁竹质量控制方法的研究▲

陆峥琳1黄瑞松1黄 琴2梁晓东3叶积秀4

(1 广西民族医药研究院民族药研究所，南宁市 530001，E-mail：499146468@qq.com；广西医科大学2 药学院，3 基础医学院，南宁市 530021；4 广西中医药大学药学院，南宁市 530001)

目的 建立壮药了刁竹全草定性鉴别方法和含量测定方法，为了刁竹的质量控制提供参考。方法 采用性状、显微、薄层层析(TLC)鉴别方法和高效液相色谱(HPLC)含量测定方法，对了刁竹进行定性和定量检测，其中HPLC色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18柱，流动相为甲醇-水(55 ∶45)，检测波长为274 nm，流速1.0 ml/min，柱温30℃。结果 在TLC鉴别中，两种鉴别方法均可见特征斑点，具有专属性，且特征性强、重复性好。应用HPLC法，当丹皮酚进样量为0.004328～0.2164 μg时，进样量与峰面积呈良好的线性关系：Y=5053.4X-1.7687，r=0.9998，平均加样回收率为99.42%；10批药材丹皮酚含量为0.15%～1.16%，平均为0.59%。结论 建立的了刁竹全草定性鉴定和定量测量标准可有效控制该药材的质量。

壮药；了刁竹；丹皮酚；质量控制；薄层层析；高效液相色谱法

了刁竹别名寮刁竹、徐长卿、逍遥竹、竹叶细辛、英雄草[1-3]，为广西壮医常用药材，其原植物来源于萝藦科植物徐长卿[4]。徐长卿入药用，中医和壮医入药部位不同，中医以根及根茎入药，壮医则多以全草入药，称为“了刁竹”，壮医认为其具有调龙路及火路、利谷道、祛湿毒、消肿痛的功效[5]。目前在广西部分药材流通市场中以根及根茎入药和以全草入药的该药材均有销售。历版《中国药典》收载的“徐长卿”均以根及根茎入药[6]，目前尚无了刁竹全草入药的质量标准，导致刁竹全草入药处于无标准控制的状态，影响了了刁竹全草临床用药的安全有效性。了刁竹主要含有丹皮酚[7-8]，丹皮酚为该药材的主要有效成分，具有镇静、镇痛、解热、抗菌、抗炎、降压、抗心律失常、抗血栓、抗动脉粥样硬化等药理作用[3]。为充分开发利用徐长卿植物资源，控制了刁竹药材质量，确保该药材临床用药的安全有效，本文对壮药了刁竹全草药材的性状、显微特征、薄层层析(thin-layer chromatography，TLC)鉴别、含量测定等项目进行研究，建立壮药了刁竹全草性状、显微、TLC鉴别方法和含量测定方法，为该药材质量标准的制订提供了试验参考依据。现将结果报告如下。

1 仪器与材料

1.1 仪器 Agilent 1260型高效液相色谱仪(安捷伦公司，带VWD检测器)，LC-20AT高效液相色谱仪(岛津公司，带二极管阵列检测器)，KQ-100DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，C300防腐蚀隔膜真空泵(德国Chemvak公司)，XS205电子天平(瑞士梅特勒公司)，EASYpureⅡ超纯水器(美国热电公司)。

1.2 材料 了刁竹药材共10批，均为全草，各批来源及收集时间见表1。其中3号样品的对号蜡叶标本经广西中医药大学和广西中医药研究院专家鉴定，确定为萝藦科植物徐长卿；丹皮酚对照品(中国食品药品检定院，批号：110708-200505)；硅胶G(青岛海洋化工厂分厂，批号 20131118)；流动相所用甲醇和乙腈均为色谱纯(美国天地公司)、水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

表1 了刁竹(全草)药材来源情况

2 方法与结果

2.1 性状 本品多扎成小捆，根不规则柱状，有盘结长0.5～3.5 cm，直径2～4 cm。部分顶端附圆柱形残茎，长1～2 cm；断面中空；根茎节处周围着生多数根。根呈细长圆柱形，弯曲，长10～16 cm，直径1～1.5 cm；表面淡黄棕色至淡棕色，具微细的纵皱纹，并有纤细的须根；质脆，易折断，断面粉性，皮部类白色或白色，形成层环淡棕色，木部细小。茎单一或少有分支，长20～60 cm，直径1～2 mm；表面淡黄绿色，具细纵纹，或被毛；质稍脆，折断面纤维性。叶对生，叶片扭曲，易破碎，完整者长披针形至线形，表面淡黄绿色，具短柄或几无柄；顶端的叶腋内偶见圆锥状聚伞花序，花冠黄绿色。气香，味微辛凉。见图1。

图1 了刁竹药材图

2.2 显微鉴别 取药材的根、茎、叶按石蜡切片法制作横切面片；取适量药材粉碎过60目筛后，将粉末放置载玻片上，滴加水合氯醛1～2滴透化，再滴加稀甘油1～2滴，盖上盖玻片，在显微镜下观察和拍照。

2.2.1 根的横切面特征：表皮细胞为一列，细胞类方形，外壁木化而增厚。皮层宽广，细胞类圆形。细胞排列疏松，有的细胞内含淀粉粒。内皮层为一列细胞，凯氏点明显。韧皮部狭窄，形成层不明显。木质部由导管及木纤维组成。见图2。

2.2.2 茎的横切面特征：茎直径约2.0 mm。表皮为一列细胞类方形，外被角质层。表皮下方有3～4列细胞含有叶绿素。皮层有断续成环的纤维束组成。韧皮部狭窄，形成不明显。木质部由导管及纤维组成，木质部射线明显。髓细胞类圆形，排列疏松。见图3。

2.2.3 叶的横切面特征：叶的上、下表皮为一列细胞，上表皮为一列细胞，上表皮细胞较大，为不规则形。叶的薄壁细胞内含草酸钙簇晶。叶肉栅栏组织为柱形，排列整齐，海绵组织疏松。维管束为外韧型，导管单列排成行，韧皮部细胞排列紧密。下表皮细胞较小，见气孔。见图4。

2.3.4 粉末特征：本品呈浅灰棕色或褐色，气清香，味微辛。淀粉粒众多，单粒类圆形，直径73～172 μm。具三复粒淀粉。草酸钙簇晶较常见，直径192～245 μm。非腺毛为单细胞，基部直径130～175 μm。导管多为螺纹导管，直径85～148 μm。具缘纹孔导管直径约286～414 μm。纤维有单根或成束，单根直径约74～135 μm。见图5。

图2 根横切面

图3 茎横切面

注：1.表皮，2.内皮层，3.纤维束，4.韧皮部，5.木射线，6.木质部，7.髓部

图4 叶横切面

注：1.上表皮，2.草酸钙结晶，3.栅栏组织，4.导管，5.韧皮部，6.下表皮

图5 粉末

2.3 TLC鉴别

2.3.1 方法一 ：取适量药材粉碎过三号筛，取粉末约1 g，加乙醚10 ml，密塞，振摇10 min，滤过，滤液挥干，残渣加丙酮1 ml溶解，作为供试品溶液。另取丹皮酚对照品，加丙酮制成2 mg/ml的溶液，作为对照品溶液。参照薄层色谱法[《中华人民共和国药典》2010年版(一部)附录ⅥB]进行试验，吸取供试品溶液5～10 μl、对照品溶液10 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯(3 ∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以盐酸酸性5%的三氯化铁乙醇溶液，加热至斑点显色清晰。结果：10批药材供试品均可检出丹皮酚斑点，且斑点分离效果好，集中清晰，重现性好，无干扰。见图6。

图6 了刁竹丹皮酚TLC图

2.3.2 方法二：取适量药材粉碎过三号筛，取粉末1 g，加乙醚10 ml，密塞，振摇10 min，滤过，滤液蒸干，残渣加丙酮1 m溶解，作为供试品溶液。另取了刁竹对照药材1 g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法[《中华人民共和国药典》2010年版(一部)附录Ⅵ B]进行试验，吸取上述两种溶液各5～10 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-三氯甲烷-乙酸乙酯(10 ∶2 ∶0.8)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，分别置日光和紫外光灯(365 nm)下检视。结果：10批药材供试品色谱中，均可检出对照药材的主要斑点及荧光斑点。本方法分离效果好，斑点集中清晰，比移值适中，重现性好。见图7和图8。

图7 了刁竹对照药材TLC图(365 nm荧光下)

注：1～2、4～10为了刁竹药材；3为了刁竹对照药材； A、B、C为 特征斑点

图8 了刁竹对照药材TLC图(日光下)

注：1～2、4～10为了刁竹药材；3为了刁竹对照药材； A、B、C 为特征斑点

2.4 含量测定

2.4.1 溶液制备：精密称取丹皮酚对照品适量，加适量甲醇制成每1 ml含10 μg的溶液，作为对照品溶液；取了刁竹(1号)药材粉末(过3号筛)0.2 g，置具塞平底烧瓶中，精密称定，精密加入25 ml甲醇，称定重量后，置水浴锅加热回流30 min，取出，放冷，用甲醇补足减少的重量，过滤，精密吸取续滤液1 ml加甲醇定容到10 ml，作为供试品溶液；另取制备供试品溶液的甲醇试剂作为阴性溶液。

2.4.2 色谱条件及测定方法：以Agilent ZORBAX SB-C18柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)为色谱柱，以甲醇-水(55 ∶45)为流动相，检测波长为274 nm，理论板数按丹皮酚峰计算应不低于3 000，对照品与供试品溶液进样量均为10 μl。

2.4.3 专属性考察：分别精密吸取上述2.4.1项的对照品、供试品和阴性溶液各10 μl，进样测定。结果：本方法测定丹皮酚含量无阴性干扰，专属性强。见图9。

图9 对照品溶液(A)、供试品溶液(B)、阴性对照液(C)HPLC图

2.4.4 方法学考察：(1)线性关系考察：分别精密吸取丹皮酚溶液(108.2 μg/ml)0.1、1、2、3、4、5 ml，各加甲醇定容至25 ml，作为不同浓度的对照品溶液。将上述对照品溶液按拟定的色谱条件分别进样，测定峰面积，以对照品的进样量(μg)为横坐标(X)，对照品峰面积(A)为纵坐标(Y)，绘制标准曲线。结果：当丹皮酚进样量在0.004328～0.2164 μg范围内时，进样量与峰面积呈良好的线性关系，回归方程：Y=5053.4X-1.7687，r=0.9998。(2)精密度试验：取同一份供试品溶液(1号)，按上述确定的色谱条件拟定的色谱条件，连续测定6次。结果：6次测定的丹皮酚峰面积平均值为160.4，相对标准偏差(relative standard deviation，RSD)=0.59%(n=6)。(3)重复性试验：取了刁竹样品粉末(1号)6份0.2 g，精密称定，分别制备供试品溶液，分别测定并计算丹皮酚量。结果：6份供试液丹皮酚含量平均值为0.42%，RSD为1.17%(n=6)。(4)稳定性试验 取同一供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、24 h精密吸取10 μl注入液相色谱仪，测定丹皮酚峰面积值。结果：6次测定测得丹皮酚峰面积的平均值为160，RSD为1.03%。

2.4.5 回收率试验： 取了刁竹(全草)粉末(1号)6份，每份约0.1 g，精密称定，各加入丹皮酚对照品甲醇溶液(15.6 μg/ml)25 ml，照2.4.1项制备供试品溶液，并测定。结果：平均回收率为99.42%，RSD为1.60%(n=6)。

2.4.6 样品测定：取表1中的10批了刁竹样品，制备供试品溶液和丹皮酚对照品溶液同2.4.1，测定方法同2.4.2。结果：10批药材丹皮酚含量为0.15%～1.16%，平均含量为0.59%。见表2。

表2 10批样品含量测定结果(n=2)

3 讨 论

3.1 了刁竹全草性状、显微、TLC鉴别方法 (1)性状鉴定。根据本文观察结果，本品性状主要特征为：根茎节处周围着生多数根，根呈细长圆柱形，表面淡黄棕色至淡棕色，质脆，易折断，断面粉性，气香，味微辛凉；茎多单一，具细纵纹；叶对生，完整者长披针形至线形。药材以茎叶茂盛，根及根茎香气浓，味微辛凉为佳。(2)显微鉴定。本实验曾对了刁竹的根横切面、茎横切面、叶横切面以及粉末进行显微观察和图片拍摄，考虑到生产检验的实际情况，编制本品质量标准正文时，只选择了具有代表性和较易操作的茎横切面和粉末特征。本品显微鉴别要点为：根横切面中，表皮细胞为一列，类方形；皮层宽广，细胞类圆形；内皮层为一列细胞，凯氏点明显。粉末中淀粉粒众多，具三复粒淀粉，草酸钙簇晶较常见，导管多为螺纹导管，纤维有单根或成束。(3)TLC鉴别。在TLC鉴别中，经不同提取方式、不同展开系统、不同显色方式、耐用性等研究，两种鉴别方法结果均可见特征斑点，专属性，特征性强，重复性好。故上述方法可作为了刁竹全草的性状、显微、TLC鉴别方法。

3.2 了刁竹含量测定方法 2010年版《中国药典》收载了中药徐长卿，其药用部位为根和根茎，以丹皮酚作为含量测定的指标。经笔者初步试验，了刁竹各部位均含有一定量的丹皮酚，据此本文以丹皮酚作为了刁竹全草含量测定的指标。《中国药典》收载的徐长卿丹皮酚含量测定方法中供试品溶液采用超声提取的方法制备。本实验中，我们曾经对1号样品分别采用回流和超声提取两种方法进行丹皮酚得率的比较，回流提取制备的供试品溶液丹皮酚含量为0.40%，高于超声提取的0.32%，故本实验最终采用水浴回流提取方法制备供试品溶液。最终建立了刁竹全草药材中丹皮酚的高效液相色谱定量测定方法。本实验测定了各批次样品，均可检出丹皮酚，10批药材丹皮酚含量为0.15%～1.16%，平均含量为0.59%，提示不同产地的含量差异较大，有必要进行质量控制。考虑到药材来源差异的情况，暂定本品丹皮酚含量限度为不低于0.20%。

[1] 广西壮族自治区卫生局.广西本草选编:下册[M].南宁:广西人民出版社,1974:1 772.

[2] 广西壮族自治区中医药研究所.广西药用植物名录[M] 南宁:广西人民出版社,1986:374.

[3] 国家中医药管理局《中华本草》编委会.中华本草(第6册)[M].上海:科学技术出版社,1999:345.

[4] 中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志：第六十三卷 [M].北京:科学出版社,1977:351.

[5] 黄瑞松.壮药选编:上册[M].南宁:广西科学技术出版社,2015:306.

[6] 国家药典委员会.中华人民共和国药典:2010年版一部[M].北京:中国医药科技出版社,2010:268-269.

[7] 林玉璇,许学健.徐长卿化学成分的研究[J].药学学报,1963,10(9):576-577.

[8] 楼凤昌,李 霞,马琴玉,等.徐长卿中异丹皮酚的结构测定[J].中国药科大学学报,1989,20(3):167-169.

Research on quality control of Zhuang medicineCynanchumpaniculatum

LUZheng-lin1,HUANGRui-song1,HUANGQin2,LIANGXiao-dong3,YEJi-xiu4

(1GuangxiAcademyofMinorityNationalityMedicineandPharmacology,Nanning530001,China;2SchoolofPharmacy,3SchoolofBasieMedicine,GuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China;4SchoolofPharmacy,GuangxiUniversityofChineseMedicine,Nanning530001,China)

Objective To establish the methods of identification and content measurement for Zhuang medicineCynanchumpaniculatum,thus to provide the reference for quality control ofCynanchumpaniculatum.Methods Qualitative and quantitative measurement forCynanchumpaniculatumwere conducted using macroscopical,microscopic identification,thin-layer chromatography(TLC) and high performance liquid chromatography(HPLC) method.Agilent ZORBAX SB-C18column was used as chromatographic column,and methanol-water(55 ∶45) as mobile phase in HPLC.The detection wavelength was 274 nm,the flow velocity was 1.0 ml/min,and temperature was kept at 30℃ in HPLC.Results In identification with TLC,characteristic spot was observed in the two identification methods.And the methods obtained specificity,obvious characteristics and good repeatability.HPLC method was used,when the sample size ofCynanchumpaniculatumwas between 0.004328 μg and 0.2164 μg,a good linear relationship was found between the sample size and peak area:Y=5053.4X-1.7687,r=0.9998,and the average percent recovery of sample was 99.42%.Of ten batches ofCynanchumpaniculatum,the contents of paeonol were 0.15%-1.16%,and the average content was 0.59%.Conclusion The established standards of qualitative identification and quantitative measurement can effectively control the quality ofCynanchumpaniculatum.

Zhuang medicine,Cynanchumpaniculatum,Paeonol,Quality control,Thin-layer chromatography,High performance liquid chromatography

广西科学研究与技术开发计划(桂科重1355001-4)；广西医疗卫生重点科研课题(重2012015)；广西壮族自治区食品药品监督管理局课题(GX2C2014-G3-1577-YL2B-B-2)

陆峥琳(1985～)，女，硕士，助理研究员，研究方向：中草药化学成分和质量标准。

黄瑞松(1958～)男，本科，主任中药师，研究方向：中草药化学成分和质量标准，E-mail：hrs.3130064@163.com。

R 291.8；R 927.2

A

0253-4304(2016)08-1127-05

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.08.22

2016-03-17

2016-06-01)