复方黄芪养心合剂对SD大鼠冠状动脉结扎术后心室及血管周围胶原重构的影响

陈启兰祝光礼龚一萍任兴昌齐国安赫小龙

复方黄芪养心合剂对SD大鼠冠状动脉结扎术后心室及血管周围胶原重构的影响

陈启兰1祝光礼1龚一萍2任兴昌3齐国安4赫小龙1

目的观察复方黄芪养心合剂（CAMNH）对SD大鼠冠状动脉结扎术后心室及血管周围胶原重构（VR）的影响。方法SD大鼠47只随机取假手术组（SO组）8只。其余39只行冠状动脉左前降支结扎术，观察10天，存活29只大鼠按随机数字表法分为三组，复方黄芪养心合剂组（CAMNH组）、美托洛尔缓释片组（MSSRT组）每组10只，心脏重构组（VR组）9只，CAMNH组MSSRT组予相应药物灌胃，VR组和SO组予蒸馏水灌胃，共计8周。计算全心室质量与体质量比（Vt/Wt）；使用改良Masson染色法观察大鼠心室重构，用Image Pro Plus 6.0图像分析系统，计算心肌组织胶原容积分数（CVF）和血管周围胶原面积（PVCA）。结果Vt/Wt：MSSRT组小于VR组［（2.77±0.26）%比（3.06±0.21）%，P＜0.05］；CAMNH组明显小于VR组［（2.67±0.17）%比（3.06± 0.21）%，P＜0.01］。CVF与PVCA：MSSRT组及CAMNH组与VR组比较明显降低［（43.89±6.83）%、（42.60±17.55）%比（59.01±6.93）%；（101.8±49.7）%、（104.1±41.2）%比（148.1±69.3）%；P＜0.01］。结论复方黄芪养心合剂能够减轻冠状动脉结扎术后SD大鼠Vt/Wt，降低VR大鼠CVF、PVCA，作用

大鼠；冠状动脉结扎术后；心脏重构；复方黄芪养心合剂；美托洛尔；心肌组织胶原容积分

心室重构（ventriclar remodeling，VR）是在各种损伤及继发性因素作用下所造成的心肌结构、功能的变化，心肌细胞外基质及血管周围胶原沉积和纤维化是VR的重要表现之一，使心肌僵硬度增加，造成心力衰竭[1]。近年来冠心病越来越成为临床常见病[2]，由于心肌缺血、梗死造成的冠心病心室重构也越来越多见。本研究观察复方黄芪养心合剂（compound astragalus mixture nourishing heart，CAMNH）对SD大鼠冠脉结扎术后心室及血管周围胶原重构的干预作用。

1 实验材料

1.1 实验动物 健康雄性清洁级Sprague-Dawley （SD）大鼠47只，体质量180～220g，8～10周龄，由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供，合格证号：SCXK（沪）2008-0016。饲养条件：饲养于浙江中医药大学实验动物研究中心，分笼饲养，每笼5只，清洁饲养室保持恒温（20℃），相对湿度40%～60%；实验动物许可证号：SYXK（浙）2008-0115。

1.2 实验药品 CAMNH处方组成和制剂工艺：黄芪（批号101010）、党参（批号101005）、太子参（批号101013）、苦参（批号101022）、丹参（批号101023）、甘松（批号101019）各20g，炙甘草10g（批号101018），生山楂15g（批号101007），单味中药均由浙江省临安市中药药材有限公司提供。将各药加水煎煮2次，第一次1.5h，第二次0.5h，由杭州市中医院药剂制剂室制备成生药浓度为2g/mL的生药煎剂，4℃冰箱保存。对照药物：美托洛尔缓释片（metoprolol succinate sustained-release tablets，MSSRT）（47.5mg/片，批号m14438）由阿斯特拉（无锡）制药有限公司提供。

1.3 主要试剂和仪器 戊巴比妥钠（规格：25g/瓶，上海西唐，批号WS20080118）；Masson三色染色试剂盒（MST-8003/8004，福州迈新）；DH-150动物人工呼吸机（浙江大学医学仪器厂）；Medlab-U/4CS生物信号采集仪（南京美易科技有限公司）；病理组织漂烘处理仪（常州效区中威电子仪器厂）；LEICA RM 2235轮转式切片机（LEICA，德国）；BX-51 OLYMPUS显微镜（Olympus，日本）；Microview MVC 1000图像采集仪（Olympus，日本）；Image Pro Plus 6.0图像分析软件（Media Cybernetics，美国）。

2 实验方法

2.1 大鼠冠脉结扎术后心室重构（ventricular remodeling，VR）模型的建立 大鼠急性心肌梗死制作参考徐叔云等[3]的方法通过左冠状动脉前降支高位结扎并略作改进[4]。结扎术后观察15min，关闭胸腔，挤出残余空气，逐层缝合胸壁组织，做好麻醉后复苏及保暖工作。假手术（sham-operated，SO）组除不结扎冠脉左前降支外，其余步骤相同。全程记录Ⅱ导联心电图并存盘。

2.2 动物分组 47只大鼠随机取假手术组（SO组）8只。其余39只大鼠行冠状动脉左前降支结扎术，术后缝合，观察10天，存活29只大鼠按随机数字表法分为三组，复方黄芪养心合剂组（CAMNH组）、美托洛尔缓释片组（MSSRT组）每组各10只，心脏重构组（VR组）9只。CAMNH组按14g/［7mL/（kg·d）］剂量灌胃；MSSRT组按9.5mg/［7mL/（kg·d）］剂量，将MSSRT研细，称重，加蒸馏水溶解后灌胃；VR组和SO组均按蒸馏水7mL/（kg·d）灌胃，共计8周。

2.3 指标检测

2.3.1 心电图 冠状动脉结扎术后10周，各组大鼠麻醉，记录心电图30s。

2.3.2 全心室质量与体质量比 称体质量（weight，Wt，g），麻醉，开胸，取下大鼠心脏，用生理盐水洗净血污，去除左右心房、心耳，用吸水纸吸去水分，称全心室质量（ventricle weight，Vt，g），计算全心室质量与体质量比（Vt/Wt，%）。

2.3.3 HE及改良Masson染色观察 标本的取材与处理：取下大鼠心脏，用生理盐水洗净血污，去除左右心房、心耳、右心室，用吸水纸吸去水分，取结扎以下部分，从心尖至心底部垂直心脏纵轴方向，将心脏切成3个组织块，厚度约2～3mm（视组织块纵径长短而定），取2个组织块置于4%中性福尔马林溶液内固定24h。将心肌组织用不同浓度酒精梯度脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，按肌肉横断面切片（厚度3μm），65℃下过夜烤干备用。

HE染色：组织切片于病理组织漂烘处理仪60℃烤片1h，二甲苯脱蜡二次，再依次梯度酒精脱水和蒸馏水水化，HE常规染色，苏木素复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树脂封片，光学显微镜观察心肌缺血情况。用彩色摄像机采集图像（×200）。

改良Masson染色：组织切片于病理组织漂烘处理仪60℃烤片1h，二甲苯脱蜡二次，再依次梯度酒精脱水和蒸馏水水化，吸取Masson复合染色液染色，去离子水洗两次；吸取磷钼酸液适量滴至标本上，5min后倾去，去离子水涮洗两次；吸取苯胺蓝适量滴至标本上，5min后倾去；直接滴加盐酸酒精分化液适量，30～60s后倾去，×2次；无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。光学显微镜观察心肌细胞与胶原纤维情况。用彩色摄像机采集图像（×400）。用Image Pro plus 6.0图像分析系统，测量心肌组织胶原容积分数（collagen volume fraction，CVF，%）和血管周围胶原面积（perivascular collagenvolume area，PVCA，%）。CVF（%）=胶原面积/总面积×100%，PVCA （%）=小动脉管腔周围胶原面积/动脉管腔面积× 100%，每一标本均至少取5个视野测量，计算其均值。

2.4 统计学方法 应用SPSS17.0软件进行统计分析。计量资料以（±s） 表示，采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

3结果

3.1 实验动物存活情况 左前降支冠脉结扎成功率为100%。冠状动脉结扎术中死亡8只，术后观察期间死亡2只，术后第6周末存活29只，存活率74.4%。术后第6周CAMNH组死亡2只，术后第10 周VR组死亡1只，余均存活至实验结束。

3.2 心电图改变 手术前，大鼠心率多数高于400 次/min，P波、QRS波、T波正常可辨；左冠状动脉前降支结扎即刻Ⅱ导联R波振幅明显抬高，ST段抬高＞0.2mV，T波、ST段与R波融合形成单向曲线，持续至手术结束，证明造模成功[4]。冠状动脉结扎术后10周，大鼠心率250～450bpm，VR组、CAMNH组及MSSRT组均可见Q波形成、QRS波及ST-T改变，部分可见早搏；SO组P波、QRS波、T波正常可辨。VR 组R波振幅减小，ST段与T波融合，T波深倒；MSSRT组：QRS波振幅增加，ST段明显压低并与T波融合；CAMNH组：QRS波振幅减小，ST段明显压低并与T波融合，可见早搏（图1）。

图1 大鼠冠脉左前降支结扎术后Ⅱ导联心电图改变

3.3 各组大鼠Vt/Wt、CVF、PVCA比较 Vt/Wt（%）VR组明显重于SO组，差异有统计学意义（P＜0.01）；MSSRT组小于VR组（P＜0.05），但是显著大于SO组，差异有统计学意义（P＜0.01）；CAMNH组明显小于VR组（P＜0.01），与SO组相近，差异无统计学意义（P＞0.05），CVF（%）：VR组与SO组相比明显增高（P＜0.01）。MSSRT组与VR组相比明显降低（P＜0.01），与SO组相比明显增高（P＜0.01）。CAMNH组与VR组相比明显降低（P＜0.01）；与SO组相比明显增高（P＜0.01）；与MSSRT组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。PVCA（%）：VR组与SO组相比明显增高（P＜0.05）。MSSRT组与VR组相比明显降低（P＜0.01）；与SO组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。CAMNH组与VR组相比明显降低（P＜0.01）；与SO组MSSRT组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 各组大鼠Vt/Wt、CVF、PVCA比较（%，±s）

表1 各组大鼠Vt/Wt、CVF、PVCA比较（%，±s）

注：与VR组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与SO组比较，★P＜0.05，★★P＜0.01；SO：假手术组；VR：心脏重构组；MSSRT：复方黄芪养心合剂组；CAMNH组：美托洛尔缓释片组；Vt/Wt：心室质量/体质量；CVF：心脏组织胶原容积分数；PVCA：血管周围胶原面积

3.4 病理形态学观察 摘取大鼠心脏时肉眼可见SO组心脏体积正常，心肌组织弹性良好，颜色鲜红，表面光滑；VR组、MSSRT组、CAMNH组心脏体积变大，颜色暗红，心肌组织弹性较差，梗死区室壁颜色灰白，其中VR组最为明显。

HE染色光镜下观察可见SO组心肌横纹清晰，心肌纤维排列整齐，胞浆染色均匀，胞核清楚，未见炎性细胞浸润（图2-A，封四）。VR组可见典型心肌梗死，梗死区心肌横纹消失，心肌纤维溶解断裂，心肌细胞断裂、核固缩、结构破坏，排列紊乱，伴有炎性细胞浸润及部分毛细血管新生；非梗死区心肌纤维排列整齐，心肌横纹清晰可见；梗死区与非梗死区之间边界清晰可见（图2-B，封四）。MSSRT组、CAMNH组病变较VR组明显减轻（图2-C、D，封四）。

改良Masson染色光镜下观察，可清晰显示心肌细胞呈红色，胶原纤维呈蓝色（图3，封四）。SO组心肌间隙有少量散在胶原纤维（图3-A，封四）；VR组红色的心肌细胞与蓝色的胶原纤维均有广泛分布并有交界，位于梗死区与非梗死区交界处，交界处可见红色的心肌细胞与蓝色的胶原纤维交错分布，大鼠心肌梗死区有大量胶原堆积，并可见坏死的不完整心肌细胞（图3-B，封四）。MSSRT组与CAMNH组可见有蓝色的胶原沉积于梗死区，但较VR组减轻（图3-C、D，封四）。

心肌内冠状动脉周围可见蓝色的胶原纤维环绕，有向细胞间质呈放射状分布的趋势（图4，封四）。SO组在冠脉周围仅见少量胶原纤维分布（图4-A，封四），VR组可见在冠脉周围大量的胶原增生，并向血管周围的间质延伸（图4-B，封四）。心肌血管周围胶原沉积MSSRT组、CAMNH组与VR组相比有明显减少（图4-C、D，封四）。

4讨论

心室重构过程一方面是指心肌细胞肥厚，心肌细胞凋亡、坏死、增生，甚至纤维化；另一方面指细胞外基质的胶原沉积和纤维化。在VR进程中，以炎性细胞因子升高为标志的免疫激活及胶原代谢异常发挥着重要作用[5]。心肌胶原是细胞外基质的主要成分，它在维持心脏结构和功能方面起重要作用。正常时胶原的生成和降解在体内处于动态平衡状态，病理条件下，胶原的增多或减少都会引起及心肌纤维化，加重心衰。赵淑明等[6]研究证明葶苈生脉方可调节慢性心力衰竭大鼠心肌胶原的代谢，改善心功能。沈祥春等[7]研究发现太子参对急性心肌梗死心力衰竭大鼠心室重构有改善作用。池一凡等[8]研究认为，黄芪可以延缓心肌纤维化及VR的进展。王伟[9]发现益气养阴活血解毒中药可缩小AMI后心室重构大鼠心肌梗死面积，抑制胶原蛋白合成、减少心肌肥厚、心肌纤维化。

本研究发现，复方黄芪养心合剂能明确降低Vt/ Wt，其作用与美托洛尔缓释片相当。在间质胶原重构方面可观察到心室重构心肌间质纤维化和血管周围纤维化并存，CVF、PVCA增大。复方黄芪养心合剂能明显降低CVF，抑制心肌间质纤维化，其作用与美托洛尔缓释片相当；复方黄芪养心合剂能明显降低PVCA，抑制心肌血管周围纤维化，其作用与美托洛尔缓释片相当。

心肌梗死后的心室重构（VR）包括胶原增生和左室的增大，属中医“胸痹”、“虚劳”等范畴。该病为本虚标实之证，主要由于心肌梗死后局部心肌血脉流行不畅，心肌供血不足，又兼手术损耗心肌之气血，气血亏虚，日久形成虚劳，造成心脏的扩大。冠状动脉左前降支结扎术后心脉流行不畅，阻塞心脉，脉络闭塞，导致水湿内停，化为湿浊。虚、瘀、湿、浊诸邪蓄积以致浊瘀内结，致心肌梗死后心肌纤维化。故而认为心肌梗死后VR的中医病机主要为气血亏虚、浊瘀内结。

复方黄芪养心合剂为院内制剂，长期临床实践显示，应用复方黄芪养心合剂治疗冠心病心脏扩大患者，可有效缓解胸闷、胸痛、气短乏力、心悸心慌等症，改善VR及心功能。之前的研究[4，10]证实，复方黄芪养心合剂可改善大鼠缺血再灌注室性心律失常，可改善大鼠缺血再灌注心肌细胞缝隙连接蛋白43 （connexin43，Cx43）的分布改变。CAMNH由黄芪、党参、太子参、苦参、炙甘草、丹参、甘松、山楂等八味中药组成，方中黄芪、党参、太子参共同补益心气，丹参、生山楂活血祛瘀、养血安心，甘松理气，苦参清热燥湿，炙甘草益气和中，全方共起益气养血、祛瘀化浊之功效。

本研究提示，在冠脉结扎术后心肌梗死所致的VR心肌纤维化血管周围纤维化的动物模型中，CAMNH对心脏重构、心肌间质和血管周围胶原重构两方面都有显著的抑制作用，其具体作用机制还有待于进一步探讨。

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（收稿：2015-01-15 修回：2015-05-15）

Effects of Compound Astragalus Mixture Nourishing Hearton Ventricle Remodeling and Perivascular Colla－gen Fibration in Rats

CHEN Qilan1,ZHU Guangli1,GONG Yiping2,Ren Xingchang3,QI Guoan4,HE Xiaolong1.1 Department of Internal Medicine,Hangzhou Traditional Chinese Medical Hospital,Hangzhou(310007),China; 2 Faculty of Traditional Chinese Medical Diagnosis,Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310053),China; 3 Department of Pathology,Hangzhou Traditional Chinese Medical Hospital,Hangzhou(310007),China;4 Department of Internal Medicine,Xiaoshan District Traditional Chinese Medical Hospital of Hangzhou,Hangzhou(311201),China

ObjectiveTo investigatethe effects of compound astragalus mixture nourishing heart（CAMNH）on ventricleremodeling（VR）and perivascularcollagen fibration in SD rats after coronary artery ligation.MethodsEight out of 47 SD rats were randomly selected to receive sham operation（SO）.Another 39 SD rats receivedligation of coronary artery and 29 rats survived after 10 d.The survived rats were randomlydivided into 3 groups:CAMNH group,metoprolol succinate sustained-release tablets（MSSRT）group and VR group.Rats in CAMNH and MSSRT groups were treated withCAMNH（14g·kg-1·d-1）or MSSRT（9.5mg·kg-1·d-1）for 8 weeks.Rats in SO and VR groups were given distilled water intragastrically.The ratio of weight（Wt,g）and ventricleweight（Vt,g）was calculated（Vt/Wt,%）.The VR of rats was observed with upgrading Masson staining and collagen volume fraction（CVF,%）and perivascular collagenvolume area（PVCA,%）were measured with Image Pro Plus 6.0 software.ResultsVt/Wt（%）in MSSRT group and CAMNH groupwere lower than that in VR group（2.77%±0.26%,2.67%±0.17%vs 3.06%± 0.21%,P＜0.05 or 0.01）.CVF（%）and PVCA（%）in MSSRT group and CAMNH group were significantly decreased compared to VR group（CVF:43.89%±6.83%,42.60%±17.55%vs 59.01%±6.93%;PVCA:101.8%±49.7%, 104.1%±41.2%vs 148.1%±69.3%;P＜0.01）.ConclusionCAMNH can reduce Vt/Wt（%）and CVF（%）and PVCA（%）in SD rats after ligation of coronary artery.The effects is similar to MSSRT.

rats;after ligation of coronary artery;cardiac remodeling;compound astragalus mixture nourishing heart;metoprolol;collagen volume fraction;perivascular collagenvolume area

浙江省中医药科技计划项目（No.2008YB012）

1杭州市中医院心血管内科（杭州 310007）；2浙江中医药大学中医诊断学教研室（杭州 310053）；3杭州市中医院病理科（杭州310007）；4浙江省杭州市萧山区中医院内科（杭州 311201）

陈启兰，Tel：13588750941，E-mail：1469013813@qq.com

与美托洛尔缓释片相当。

数；血管周围胶原面积