CX3CR1多态性与中药治疗2型糖尿病肾病尿蛋白疗效的关系

朱阿楠方亚君王利峰陈洪宇

CX3CR1多态性与中药治疗2型糖尿病肾病尿蛋白疗效的关系

朱阿楠1方亚君1王利峰1陈洪宇2

目的观察CX3CR1-V249I基因多态性与中药治疗2型糖尿病肾病疗效的关系。方法糖尿病肾病患者108例随机分为对照组（西医治疗）和中药组（西医治疗联合中药参芪地黄汤加减），予相应治疗3个月。全部患者治疗开始前均接受CX3CR1-V249I基因多态性检测。治疗前、后检测糖化血红蛋白、尿白蛋白、尿α1微球蛋白（α1MU）、血β2微球蛋白（β2MU）、趋化因子Fmetalkine（FKN）、核因子-κb（NF-κb）、白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等。结果108例中CX3CR1-V249I野生型（VV）87例，突变型（Ⅵ+Ⅱ）21例。治疗后两组不同基因型患者尿白蛋白、尿α1MU、血β2MU较治疗前均有明显下降（P＜0.05）。中药组突变型疗效明显优于对照组突变型［尿白蛋白：（642.7±42.1）mg/L比（815.4±59.7）mg/L，P＜0.05；尿α1MU：（73.21±10.06）mg/L比（84.5±11.01）mg/L，P＜0.05；血β2MU：（37.42±9.04）mg/L比（51.12±10.57）mg/L，P＜0.05］。中药组治疗后血清NF-κB、FKN、IL-6、TNF-α含量较治疗前明显减少（P＜0.05）；与对照组突变型比较，中药组突变型患者下降更明显，差异有统计学意义［NF-κb：（0.32±0.07）ng/mL比（0.53±0.09）ng/mL，P＜0.05；FKN：（0.75±0.09）ng/mL比（0.91±0.14）ng/mL，P＜0.05；IL-6：（121.21±22.65）pg/mL比（140.26± 22.1）pg/mL，P＜0.05；TNF-α：（57.16±8.31）ng/mL比（69.12±16.55）ng/mL，P＜0.05］。结论参芪地黄汤能有效减少2型糖尿病肾病患者尿白蛋白、尿α1MU、血β2MU、FKN、NF-κb、IL-6、TNF-α含量，保护肾脏组织，这一作用在CX3CR1-V249I突变型患者中更加明显。

糖尿病肾病；参芪地黄汤；CX3CR1；V249I；基因多态性；炎症介质

糖尿病肾病（DN）属中医“消渴、虚劳、腰痛、水肿”等范畴。中医认为其病机以阴虚为本、燥热为标；西医认为DN是多种因素共同作用的结果，有学者认为DN是一种炎症性疾病[1]。近年发现FKNCX3-CR1是介导肾脏炎性细胞浸润的重要因子[2]。本研究分析糖尿病肾病患者CX3CR1基因中V249I位点多态性分布情况，应用中药参芪地黄汤加减治疗DN前后测定相关炎症介质及尿微量白蛋白的含量，探讨CX3CR1基因多态性与炎症介质对DN病理生理过程的影响，分析中药对于DN患者V249I基因非野生与野生型是否同样有效。

1 临床资料

1.1 一般资料 108例均为2009年1月—2013年12月本院门诊或住院DN患者，采用SPSS程序完全随机设计分组将患者分为中药组54例，男34例，女20例，平均年龄（62.56±10.34）岁，平均糖尿病病程（9.20±2.35）年。对照组54例，男36例，女18例，平均年龄（58.99±9.01）岁，平均糖尿病病程（8.50±2.01）年。两组年龄、性别及病程比较差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。所有患者在治疗开始前接受V249I基因检测，签署知情同意书。

1.2 诊断及排除标准 诊断均符合1999年WHO糖尿病诊断及分型标准[3]，尿微量白蛋白排泄率30～300mg/24h，符合早期糖尿病肾病的诊断标准，排除由原发性肾病、发热、泌尿系感染、原发性高血压、心力衰竭等原因引起的尿蛋白，无严重心、脑、肝脏及其他内分泌疾病，无近期使用肾毒性药物史。中医诊断：消渴；纳入阴虚热盛、气阴两虚、阴阳两虚3型[4]。

2方法

2.1 治疗方法 两组患者均予糖尿病教育及饮食控制，对照组予口服降糖药物或皮下注射胰岛素，合并高脂血症者予阿托伐他汀片20mg，每晚1次，口服调脂治疗。中药组在对照组基础上加用参芪地黄汤加减：党参、山药、泽泻各15g，黄芪30g，山萸肉15g，丹皮10g，茯苓、生地各12g。气虚明显者加重参芪用量为党参20g，黄芪45g；阴虚甚者加玄参、知母各10g；阳虚甚者加附片（先煎）、肉桂粉（后下）各3g。1 天1剂，水煎分两次服用；每周5天，休息2天，总疗程3个月。

2.2 CX3CR1-V249I基因多态性检测 治疗前行人

外周血全血基因组DNA提取及CX3CR1基因多态 性分析。受试者常规禁食12h以上，空腹抽取肘静脉

血5mL，EDTA-K2抗凝，置于-70℃低温冰箱保存。

取300μL全血，利用外周血DNA提取试剂盒提取基 因组DNA，样本吸光度OD260/OD280比值在1.7～

2.0，DNA浓度为50～150ng/μL。根据基因文库调取的CX3CR1基因序列，使用Prime5软件进行引物设计，由杭州艾迪康医学研究中心合成上游引物：上游引物：5’TCATCCAGACGCTGTTTTCC-3’，下游引物：5’-GGCATTTCCCATACAGGTG-3’。PCR产物经测序，总长为588bp。NCBI上进行BLAST，确认为目的基因，符合研究设计。使用限制性内切酶AclⅠ对V249I酶切位点进行酶切。

2.3 观察指标及方法 两组患者治疗前后禁食12h以上，次日晨空腹采肘部静脉血液6mL，采血前避免剧烈活动及应激等，血标本静置1h左右（室温），3000r/min离心10min后分离血清，分装保存于-70℃冰箱中待检。采用双抗体夹心酶联免疫吸附法（ELISA）测定血清趋化因子Fmetalkine（FKN）、核因 子-κb（NF-κb）、白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因 子-α（TNF-α）浓度；应用西门子BN-2全自动免疫分析仪，采用散射比浊法检测尿白蛋白及尿α1微球蛋白（α1MU）；应用自动生化分析仪检测血β2微球蛋白（β2MU）。

2.4 统计学方法 应用SPSS17.0软件包进行统计 分析，计量资料以（±s） 表示，采用t检验或方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 Hardy-Weinberg平衡 两组患者CX3CR1基因多态性进行Hardy-Weinberg平衡检验，两组差异无统计学意义（P=0.5792），说明群体基因遗传平衡来自同一孟德尔群体。

3.2 CX3CR1基因V249I酶切结果 结果显示，V249I多态位点中，出现1条条带295bp，为突变型 纯合子Ⅱ型，出现2条条带104bp和191bp，为野生型纯合子VV型，出现3条条带104bp、191bp和295bp，为杂合子Ⅵ型。见图1。其中对照组VV型44例，Ⅵ型8例，Ⅱ型2例；中药组VV型43例，Ⅵ型9例，Ⅱ型2例。

图1CX3CR1基因V249I酶切电泳结果

3.3 两组治疗前后肾病指标比较 治疗前同组内V249I野生型（VV基因型）患者较突变型（Ⅵ+Ⅱ基因型）患者尿白蛋白、α1MU、血β2MU含量高，差异有统计学意义（P＜0.05）。治疗后两组患者糖化血红蛋白含量均有降低，但各组同一基因型治疗前后无明显变化（P＞0.05）；两组不同基因型尿中白蛋白、尿α1MU、血β2MU较治疗前均有明显下降（P＜0.05）；中药组中突变型者疗效明显优于对照组突变型者（P＜0.05）。见表1。

3.4 两组不同基因型患者治疗前后血清炎症介质含量比较 治疗前，同组内V249I野生型患者NF-κB、IL-6、TNF-α含量高于突变型患者，FKN含量低于突变型患者，差异有统计学意义（P＜0.05）。对照组中突变型患者NF-κB、TNF-α含量治疗后较治疗前降低（P＜0.05）；中药组中无论突变型患者还是野生型患者血清NF-κB、FKN、IL-6、TNF-α含量治疗后较治疗前均明显减少（P＜0.05）；中药组突变型患者血清NF-κB、FKN、IL-6、TNF-α含量比对照组突变型下降更明显，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

3.5 不良反应 中药组出现轻微肝功能损害3例，予停药及保肝治疗后转氨酶恢复正常。

表1 两组不同基因型患者治疗前后肾病指标比较

表2 两组不同基因型患者血清炎症介质含量比较

4 讨论

DN是糖尿病（DM）最常见并发症之一，有研究[2]证明，fractalkine/CX3CR1是介导肾脏炎性细胞浸润的重要因子。FKN与CX3CR1结合以后，通过与G-蛋白偶联，激活蛋白激酶C（PKC），形成级联反应，促进单核细胞表达TNF-α和NF-κB，产生相应的生物学效应[5]。近年发现CX3CR1基因中存在V249I碱基突变，这种遗传变异对CX3CR1和FKN的亲和力产生明显影响，并影响炎症过程中白细胞的游走、黏附和聚集，进一步影响DN的遗传易感性[6]。中医认为DN病机以阴虚或气阴两虚为主，且因消渴日久，耗气伤津灼液，气虚津亏液少而成瘀血，因此中医治疗多采用补肾滋阴加活血化瘀为主[7-8]。

本课题组以往研究[9]中发现，DN患者NF-κB、FKN、IL-6、TNF-α含量较健康对照者明显升高，说明这些炎症介质在DN发病中起到重要作用。本研究发现，同组内V249I野生型患者尿中白蛋白、α1MU、血β2MU、NF-κB、IL-6、TNF-α含量高于突变型患者，FKN含量低于突变型患者（P＜0.05）。虽然突变型患者FKN含量较高，但CX3CR1-V249I突变型对FKN的趋化活性下降，与FKN的结合率也降低[9]。而DN患者CX3CR1-V249I野生型相对突变型而言，CX3CR1表达增加，对FKN的趋化活性增强，FKN-CX3CR1系统激活，单核细胞表达NF-κB和TNF-α增加，肾血管内皮细胞和系膜细胞的损伤，促进了糖尿病肾病的发生发展；NF-κB的增加促使血清IL-6升高并刺激肾小球系膜增殖、细胞外基质的产生，使肾小球滤过膜增厚[5，10]，加速了DN的发生发展。

参芪地黄汤源于清沈金鳌《沈氏尊生书》，由党参、黄芪、生地、山药、山茱萸、茯苓6味药组成，功效为益气养阴、健脾补肾。方中党参、黄芪、生地共为君药。黄芪助脾运以升清，助肾之气化与封藏以固摄精微，合党参以增强补气之功；生地黄与党参、黄芪合用，健脾补中而不温燥，益肾养阴而不滋腻。山茱萸、山药、茯苓共为臣药。山茱萸滋阴涩精，山药滋肾补脾，茯苓淡而平，健脾益气，渗湿利水，与山药相须为用，共助君药健脾补肾，益气养阴。泽泻清泻肾火，牡丹皮清泻肝火，并制山茱萸之温；佐以丹参、桃仁活血祛瘀。在补益药物中配以活血祛瘀药，可使补益药物无滋腻壅满之弊。全方共奏益气养阴、活血祛瘀之

功[11]。

本研究显示，中药组尿白蛋白、α1MU、β2MU等指标治疗后明显改善，在V249I突变型患者中尤为明显。而且中药组患者服用参芪地黄汤治疗3个月后，NF-κb、FKN、IL-6、TNF-α含量较治疗前均有明显减少，与对照组同基因型患者相比，突变型患者治疗效果更加明显。说明参芪地黄汤加减可抑制糖尿病肾病的炎症反应，降低NF-κB、FKN、IL-6、TNF-α等炎症因子的含量，进一步减少糖尿病肾病患者尿白蛋白、α1MU、β2MU等相关指标。中药益气养阴、活血祛瘀的功效可延缓糖尿病肾病的发展，但其分子机制有待进一步研究。

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（收稿：2015-06-18 修回：2015-09-09）

Correlation of Gene Polymorphism of CX3CR1 with the Effect of Traditional Chinese Medicine on UrineProteinsin Patients with Type 2 Diabetic Nephropathy

ZHU A'nan1,FANG Yajun1,WANG Lifeng1,CHEN Hongyu2. 1 Department of Internal Medicine,Traditional Chinese Medicine Hospital of Yuyao City,Yuyao(315400), China;2 Department of Nephrology,Hangzhou Chinese Medical Hospital(310006),China

ObjectiveTo investigate the relationship between CX3CR1-V249Igene polymorphism and the effect of Chinese medicineon treatment of type 2 diabetic nephropathy.MethodsA total of 108 patients were randomly divided intocontrol group（western medicine therapy alone）and Chinese medicine group（western medicine combined with Chinese medicine Shengqi Dihuang Decoction）.Patients in each group received the corresponding treatment for consecutive 3 months.Blood HbA1c,urinary albumin,urinary α1MU,serumβ2MU,FKN,NF-κb,IL-6,and TNF-αwere measured before and after treatment.ResultsEighty-seven patients had VV wild genotype of CX3CR1-V249Igene,and another 21 patients had non-wild genotype（VI+II）.The level of urinary albumin,urinary α1MU andserumβ2MU were decreased in both groups after treatment（P＜0.05）.Compared to patients with VI+II genotype in control group,those in Chinese medicine group had lower levels of urinary albumin（642.7±42.1mg/L vs 815.4±59.7mg/L）,urinary α1MU（73.21±10.06mg/L vs 84.5±11.01mg/L）andserumβ2MU（37.42±9.04mg/L vs 51.12± 10.57mg/L）,with all P＜0.05.The levels of NF-κB,FKN,IL-6 and TNF-α were decreased after Chinese medicine treatment（P＜0.05）,especially in patients with VI+II genotype（NF-κB:0.32±0.07ng/mL vs 0.53±0.09ng/mL;FKN: 0.75±0.09ng/mL vs 0.91±0.14ng/mL;IL-6:121.21±22.65pg/mL vs 140.26±22.1pg/mL;TNF-α:57.16±8.31ng/mL vs 69.12±16.55ng/mL;all P＜0.05）.ConclusionShengqi Dihuang Decoction could decrease the levels of urinary albumin and urinary α1MU,serum β2MU,FKN,NF-κb,IL-6,and TNF-α and attenuate inflammation in kidneyinpatients with type 2 diabetic nephropathy.This effect is more obvious in patients with non-wild genotype of CX3CR1-V249Igene.

diabetic nephropathy;Shengqi Dihuang Decoction;CX3CR1;V249I;gene polymorphism;mediators of inflammation

浙江省余姚市科技计划项目（No.2009Y11）

1浙江省余姚市中医医院内科（朱阿楠）、肾内科（方亚君、王利峰）（余姚 315400）；2杭州市中医院肾内科（杭州 310006）

朱阿楠，Tel：13738402869；E-mail：yylinyanrong@163.com