不同龋敏感儿童牙菌斑微生物多样性分析

颜正豪褚昊月，2郭静张晟亓庆国



不同龋敏感儿童牙菌斑微生物多样性分析

颜正豪1褚昊月1，2郭静1张晟1亓庆国1

【摘要】目的 利用高通量测序方法，研究ECC儿童和S-ECC儿童牙菌斑微生物的多样性变化，探索儿童龋病的病因学。方法 采集ECC儿童和S-ECC儿童牙菌斑样本，利用Illumina MiSeq测序方法，针对16SrRNA基因V4变异区设计通用引物进行测序分析菌群微生物的群落变化。结果 测序总共测得1 669 057条有效序列，平均有效率为89.16%，共1 514个操作分类单位（OTU）。结论 儿童龋病的发生发展与链球菌属等菌属密切相关，其种群的多样性呈现特异性的富集。

【关键词】低龄儿童龋；牙菌斑微生物；微生物多样性；高通量测序

儿童龋病严重影响儿童的口腔及身心健康，其发病是口腔牙菌斑生态平衡失调的结果[1-2]。本研究利用高通量测序平台对ECC儿童和S-ECC儿童牙菌斑进行群落分析，以期为儿童龋病生态学的评估提供新的研究策略。

1 材料及方法

1.1 样本采集、儿童牙菌斑微生物总DNA提取

由两名口腔专业医师担任检查者，无菌探针刮取乳磨牙颊面菌斑。记录龋失补牙面数低龄儿童龋（early childhood caries，ECC；dmfs≥1），重度低龄儿童龋（severe early child-hood，S-ECC）纳入标准为患儿口内龋失补牙面数（dmfs）≥4（3岁），≥5（4岁），≥6（5岁）[3]。每组各20人。随机抽取8名ECC儿童和7名S-ECC儿童牙菌斑。采用CTAB法对样本的基因组DNA进行提取，并送诺禾致源公司进行测序。

1.2 信息分析流程

1.2.1 α-多样性分析 分析样品内的群落多样性，利用Qiime软件（Version1.7.0）对样品复杂度指数进行分析。

1.2.2 物种丰度注释 根据样品在门和属水平的OTU进行聚类分析。

1.2.3 OTU分析 利用Uparse软件对所有样品的全部有效序列进行聚类并形成OTU并行分析。

1.3 统计学方法

所有结果使用SPSS 21.0软件进行分析，采用配对样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 测序数据特征

测序总共得到1 856 169条原始序列，经过预处理和统计分析得到1 669 057条有效序列，平均每个样本57 554条序列，平均有效率为89.16%。所有样本的平均序列读长249bp。

2.2 测序结果分析口腔菌群组成和分布

2.2.1 在门水平上进行分类 通过测序可以获知菌斑微生物群落中一共有27种菌门。在ECC和S-ECC儿童中有10种菌门占优势，它们是：变形菌门（Proteobacteria），放线菌门（Actinobacteria）等。这些菌门占到90%以上，随着时间推移这些菌门在ECC和S-ECC中呈现富集状态。在菌斑中所占比重较多的为螺旋菌门，TM7等。在两个时间点的ECC儿童和SECC儿童中均有统计学差异（P＜0.001），但仅在ECC儿童中随时间变化呈现统计学差异（P ＜0.001）。

2.2.2 在属水平上进行分类 在属水平上有525种菌属，有10种菌属占主导地位，Streptococcus（链球菌属）等在ECC和SECC中占主导地位的菌属，其在基线和1年后的ECC和SECC比较差异有统计学意义（P＜0.001），在ECC儿童中随时间变化呈现统计学差异（P＜0.05），在SECC中并未见统计学意义（P＞0.1）。

3 讨论

利用16SrRNA基因扩增子进行微生物概貌分析，可以提取到更高数目的序列参与分析并能检测低丰度的细菌种类[4-5]。我们采用了Illmina MiSeq测序方法检测菌斑微生物群落的多样性，在很大程度上取决于用来分析的测序总序列数[6]。 与他人研究[7]相比，我们的研究序列数量较高，可能与PCR中的有一定的偏离率、DNA提取过程中存在一些未知的杂质[8]有关，我们用测序方法对微生物群进行分析，并达到一定的深度，虽然在16S rRNA的高度变异区V4区仅选取了这些短的序列，但其具有良好的辨识度，并且足以用来进行分类分析。

本研究发现有27种菌门和525种菌属。在研究中口腔微生物群落分析中主要有5种菌门所占比例较高，提示这些菌属是与龋病发生相关是优势菌属，且随着年龄的改变这些种群的转换在ECC和S-ECC中基本上未发生有差异的改变，说明这些菌群微生物与龋病的进展高度有关。在主成分分析中，微生物群落组成相似并呈现聚集性，说明 ECC儿童与S-ECC儿童之间在门、属和种等微生物分类上差异性不明显；且同一群体在基线和1年后仅有个别门属有差异，表明在龋病的发展进程中呈现群落聚集性。

参考文献

[1]周学东，岳松龄.实用牙体牙髓病治疗学[M].北京：人民卫生出版社，2004：108-110.

[2]刘源，邹静，尚冉.不同饮料对不同龋敏感儿童牙菌斑pH值的影响[J].华西口腔医学杂志，2006，24（5）：415-418.

[3]蒋琳，庄庆明，王金华，等.重庆市学龄前儿童龋病状况调查[J].华西口腔医学杂志，2014，32（5）：472-475.

[4]褚昊月，孙静，张颖，等.不同龋敏感儿童牙菌斑中4种致龋菌的动态监测分析[J].上海口腔医学，2015，24（3）：321-325.

[5]李伟明，石四箴.澳门幼儿乳牙龋病及龋病活跃性的分析研究[J].临床口腔医学杂志， 2010， 26（5）：259-263.

[6]李志杰，王少果，李跃烘，等.高通量测序研究种植体周围炎龈下微生物多样性[J].四川大学学报（医学版），2015，46（4）：568-572.

[7]刘芳，冯锦虹，仵楠，等.维吾尔族和汉族不同龋敏感儿童变异链球菌和远缘链球菌的检测[J].新乡医学院学报，2013，30（5）：340-344.

[8]乌仁图雅.应用454焦磷酸测序技术对传统发酵乳制品微生物多样性的研究[D].呼和浩特：内蒙古农业大学，2014：12-14.

作者单位：1 250012济南，山东大学口腔医学院/山东省口腔生物医学重点实验室；2 271000 山东省泰安市中心医院口腔科

Analysis of Children With Different Caries Plaque Microbial Diversity

YAN Zhenghao1CHU Haoyue1, 2GUO Jing1ZHANG Sheng1QI Qingguo1, 1 School of Stomatol-ogy Shanodong University / Shandong Province Key Lab of Oral Biomedicine, Ji’nan 250012, China, 2 Department of Stomatology Tai'an City Central Hospital, Tai'an 271000, China

[Abstract]Objective To study the microbial diversity of ECC and S-ECC in the dental plaque with high-throughput sequencing, and investigate the possible etiology of dental caries of children.Methods Describe the bacterial profile shifting in different caries states by pyrosequencing analysis based on 16SrRNA gene V4 hyper variable regions.Apply Illumina MiSeq pyrosequencing for analysis random drawing for the ECC and S-ECC.Results In the clonal analysis, a total of 1 669 057 high-quality sequences were produced, accounting for 89.16 % of valid sequences, a total of 1 514 operating units (OTU).Conlusion With the occurrence and development of Streptococcus spp.and other dental caries in children is closely related to the diversity of the population showed specific enrichment.

[Key words]Early childhood caries, Dental plaque microorganisms, Microbial diversity, High-throughput sequencing

doi：10.3969/j.issn.1674-9308.2016.07.020

【文章编号】1674-9308（2016）07-0029-02

【中图分类号】R788

【文献标识码】A