中药新药非临床安全性研究和评价的思考

岑小波，韩 玲

（1.四川大学华西医院/临床医学院国家成都新药安全性评价中心，四川成都 610041；2.国家食品药品监督管理总局药品审评中心，北京 100038）

中药新药非临床安全性研究和评价的思考

岑小波1，韩 玲2

（1.四川大学华西医院/临床医学院国家成都新药安全性评价中心，四川成都 610041；2.国家食品药品监督管理总局药品审评中心，北京 100038）

岑小波，四川大学华西医院/临床医学院国家成都新药安全性评价中心，主任，博士，教授，博士生导师，国家新药审评专家，四川省学术和技术带头人，四川科技创新团队带头人。长期从事药物非临床研究及药物毒理学研究。主持国家自然科学基金、国家科技重大专项、国家重点科技攻关计划和省部级课题等。发表文章76篇，其中SCI论文52篇；主编专著1部，获授权发明专利6项。获四川省科技进步一等奖、成都市科技进步一等奖、高等学校科学研究成果二等奖和华夏医学科技进步二等奖各1项。担任中国毒理学会药物毒理专业委员会副主任委员、中药与天然药物毒理与安全性评价专业委员会副主任委员。作为国家成都新药安评中心创始人之一，带领团队建立了国际化、规范化的安评技术平台，完成500多个药物的非临床安全性研究评价。

安全、有效和质量可控是药物的三大基本要求，中药也不例外。在当前生命科学、医学和药学迅猛发展的时代，中药也迎来发展的崭新时代。面对中药悠久的文化沉淀、现代药理毒理学、当代相关国际技术法规以及人们对药物安全性的期待，如何科学合理地研究评价中药尤其是复方中药，已成为中药研发的一个关键。本文主要阐述当前中药非临床安全性研究的技术要求，重点分析复方中药非临床安全性研究的技术难点与特点。结合笔者对药物安全性研究和评价的认识与实践，对中药安全性研究和评价的技术要求和重点关注领域等进行阐述。

非临床安全性评价；中药；毒性

中药作为传统医药历经千年的人体应用，为华夏子孙的生命健康做出巨大贡献。如今，中药已经发展形成了成熟的理论体系，如炮制、药性、配伍和方剂等，极大地促进中药的继承与发展。长期以来中药被认为具有“安全、低毒”的特质，使有些研发者不重视中药的安全性研究。近10年来，随着中药不良反应报道日益增多，人们对中药安全性越来越关注，如马兜铃酸事件、龙胆泻肝丸事件、鱼腥草注射液事件和云南白药事件等。国外也不时有中草药毒副作用的报道，如欧洲减肥中药引起肾衰、日本小柴胡汤引起的“间质性肺炎”和新加坡“黄连毒性事件”等，这些事件在国际上引起较大影响。另一方面，随着药物毒理学的发展和新技术新方法的应用，也发现越来越多的中药具有毒性，如柴胡、独活、黄芩、吴茱萸和千层塔等中药以及小柴胡汤、斑秃丸、加味逍遥散和痔血胶囊等中药复方制剂［1-2］。如何科学研究评价中药的安全性已成为制药工业界、研发机构、学术界及药物审评机构的关注点。

安全、有效和质量可控是药物的三大基本要求，中药也不例外，药物安全是关乎国计民生的大事。近10年来，制药工业界进一步强化实施规范化的中药材种植、严格的质量标准及标准化提取加工工艺，学术界加强中药非临床安全性的科学研究及技术创新，药品监管机构重视中药新药的科学审评与上市前后的安全性评价及不良反应监测，这些举措对保障中药安全性均起到非常重要的技术支撑与政策保障作用。引起中药不良反应的因素比较多，也比较复杂，包括中药材问题（如重金属和农药超标）、不当的中药材加工炮制、不当的临床应用（超期使用，超量使用，未辨证论治）以及与化学药的相互作用等［3］。这些内容不在本文中阐述。

目前，我国《药品注册管理办法》中，对中药新药分类包括中药和天然药物，其中中药新药又包括了民族药。不同的中药新药根据成分组成或处方组成不同又可分为单味药制剂（如有效成分、有效部位新药）和复方制剂。在各种类别的中药新药中，复方中药最富有哲学与医学的科学文化，也最能体现中药临床应用优势和特色的，是中药新药研发关注的重要领域。本文将重点讨论复方中药的非临床安全性研究和评价。

1 中药非临床安全性研究的技术内容

无论对于中药、天然药物、化学药物及生物技术药物，非临床安全性研究的目的都是相同的，即旨在发现药物毒性与毒性靶器官，寻找毒性剂量与安全剂量，权衡药物进入临床的人体受益与风险，为药物进入临床研究提供科学依据。因此，为保障药物进入临床试验的人体安全性，在非临床阶段应尽量采用全面、科学、灵敏和规范的策略、方法及技术以发现药物的潜在毒性，已成为国际社会的共识。只有全面发现并识别药物毒性，才能预测药物进入临床后患者的风险，才能有针对性地制定药物毒性的监测方案及防控措施，中药也不例外。非临床阶段药物毒性的发现并非简单成为药物研发成败的判决，而是需要综合权衡的分析判断。因此，需树立科学的药物毒性认识观，清晰认识药物毒性研究的目的及安全性问题的本质内涵。

药物非临床安全性研究主要包括2种动物种属的单次给药与反复给药毒性试验、毒代动力学试验、安全药理学试验、生殖毒性试验、遗传毒性试验、致癌试验、依赖性试验、局部毒性及过敏性试验等。中药新药尤其是复方制剂的非临床安全性评价，按照现行的《药品注册管理办法》及相关技术要求，相对于化学药来说要求并不全面。例如，对于中药复方一般只要求1种动物（一般是大鼠）的单次与多次给药毒性试验，且在特殊毒性（生殖毒性、遗传毒性以及致癌性）、毒代动力学和安全药理等方面的研究评价方面，尚无统一的要求。但对于含有毒性药材的复方中药，或者当大鼠毒性试验出现明显毒性时，需采用第2种动物种属进行重复给药毒性试验。

在过去10年中，笔者带领的团队在GLP条件下完成60余个中药复方的非临床安全性研究，其中约30%受试复方中药发现毒性，少部分出现明显毒性。其中采用现代提取工艺（如大孔树脂提取、超临界CO2萃取）制备的中药复方，出现毒性反应的比例相对较高，这与现代提取制备工艺导致药物成分或（和）毒性成分的富集密切相关。分析所出现的毒性靶器官与毒性特征可以看出，肝和肾毒性仍是中药复方的主要毒性，肝和肾是主要的毒性累及器官，其次为胃肠道、免疫系统、造血系统、生殖系统和皮肤等。内分泌系统、脾、心脏和肺的毒性也在个别试验中发现。此外，在中药新药注册申报的评审过程中，也发现了一些值得关注的问题。如改变传统应用工艺后出现毒性、含毒性药材的复方中药出现预期或非预期的明显毒性、不含毒性药材的常用药材组成复方后出现非预期毒性等。从实验研究与审评的实践情况看，当前中药的非临床安全性并非想象中的那么乐观。如何科学、客观地研究评价复方中药毒性，已成为中药复方继承与创新发展的关键环节之一。是否应针对不同处方的中药特点，结合以往的临床应用经验及工艺是否有改变等情况进行分层及分阶段的研究探索是需要思考和函待解决的问题。

2 中药非临床安全性研究的技术特点和难点

2.1 毒性试验给药制剂的质量控制

中药质量控制体系的科学性影响中药非临床安全性的研究质量及结果外推。为了保证毒性试验受试样品的质量、稳定性、含量准确性能够充分代表进入临床（或上市）的样品或药物，GLP毒性试验一般都要求给药制剂含量、均一性及稳定性的分析，以确保给药制剂的剂量准确且质量稳定，从而保障毒性试验结果的可靠性和可重复性。除了委托方应提供详细的供试品质量检验报告外，供试品分析包括以下内容［4］：①给药制剂的稳定性和均一性。若供试品需经溶解（混合、混悬或溶解）后给药，应检测配制后供试品在溶剂中的稳定性和均一性，且浓度范围能覆盖全部毒性试验的浓度范围。对配制过程和配制后可能影响稳定性的因素也应进行考察，如溶媒、浓度、搅拌方法、温度和配制后储存时间等，以确保给药制剂的稳定性满足实验要求［4］。化学药物所有或绝大多数成分的稳定性与均一性能够被检测，因此常通过给药制剂稳定性研究决定毒性试验过程中的配药频率。但由于中药复方制剂常常缺乏全部或大部分药物成分配制后的稳定性数据，因此建议尽可能给药前现配，以减少对未检测成分稳定性的影响。②浓度分析。检测配制后供试品的浓度。一般在毒性试验首次给药、末次给药时进行给药制剂的分析。对于实验周期较长（如6～9月）的毒性试验，可以在试验中期增加分析频率。在进行正式毒性试验前，需对上述检测方法与内容进行验证，验证通过后在正式试验中严格按照确定的试验方案实施。

给药制剂配制与分析的准确性与全面性，直接影响非临床安全性试验结果［2，4］。由于中药成分复杂，溶解性差，质量控制指标不够全面和完善，只能反映有限的指标性成分，对于其他未检测的药物成分，其含量、稳定性和均一性都是未知的。在给药样品配制过程中，应避免加热和长期搅拌等可能使中药成分产生变化的外在因素。此外，长周期毒性试验的样品需求量大，有时为多批样品，即使控制指标成分在不同批次样品是一致性的，但也无法证明其他未检成分的一致性。因此，由此带来的毒性效应的差异难以预测，尤其对于质控指标成分含量比例较低的复方中药，这是中药毒性试验给药制剂分析的难点，不像化学药物能够全面反映给药制剂的药物含量及稳定性。

工艺稳定性是保证受试样品物质基础一致性的基础，不稳定的生产工艺可能导致不同批次的样品质量不一致，导致安全性试验结果也出现差异［5-6］，尤其当工艺变化带来物质基础的差异不能通过含测指标的检测加以反映时。溶媒选择也要慎重，这不仅保证所配制给药制剂的均一性，有时也能对试验结果产生影响。有些添加特殊辅料的中药制剂，其药物成分的体内释放与吸收可能与原料药（中药浸膏）存在较大差异。在这种情况下，应尽可能采用含有特殊辅料的中药制剂进行毒性试验，但同时需要考虑单独设立辅料对照组以排除辅料对试验结果的干扰。此外，毒性试验期间供试品的合理保存也是一个重要环节。试验样品如干膏可能存在吸潮性，一些未知成分对光、对高温的不稳定性等。因此，需要充分考虑在整个毒性试验过程中样品保存的科学合理性。

2.2 部分中药质控成分与安全性关联性差

不考虑药物代谢产物等因素，对于单一成分的化学药物，发挥药效学与毒性效应的大多为同一成分。复方中药常常采用多糖、总黄酮、绿原酸、总皂苷和总生物碱等作为质控指标，这些指标可能与药理作用存在一定关联性，但与潜在的毒性效应可能存在关联性，但也可能缺乏关联性、甚至无关联性，从而导致对药物安全性的控制缺乏实际意义。复方中药的一些质量控制指标常常是“不低于”，似乎是含量越高越好。当这些指标成分为安全性较高的成分时，对药物毒性试验结果及安全性评价可能影响不大；但当这些成分具有潜在毒性时，这种质量控制对毒性试验结果及安全性外推影响较大。采用成分含量低的中药制剂进行毒性试验时，可能出现“假阴性”结果，低估了毒性；当采用含量高的中药制剂进行毒性试验时，可能出现“假阳性”结果，即高估了毒性，影响中药研发的判断与审评。例如，山豆根具有肝肾毒性，其中所含的氧化苦参碱或（和）苦参碱可能既是有效成分，也是毒性成分［7］。如果该成分以“不低于某一含量”作为药学质控指标，当临床试验样品中该成分含量超过毒性试验用样品时，毒性试验样品不能充分反映今后临床试验或上市的中药，则可能出现临床安全性风险。另外，由于中药药味多，有时毒性成分虽然基本明确，但不少成分缺乏相应的对照品而难以检测。例如，对千里光的质量检测，我国以阿多尼佛林碱为对照品，而欧美认为千里光中所含的肝毒性生物碱成分除了阿多尼佛林碱以外，还有倒千里光裂碱等其他生物碱成分［8］。因此，当毒性成分指示指标不够完善、全面时，中药成分的变动可以使毒性试验结果预测临床不良反应风险的可靠性降低。

2.3 动物给药量大带来的试验干扰

中药临床使用剂量一般都比较大。在非临床安全性试验研究中，为了达到较高的药物体内暴露量，毒性试验的设计剂量较高，可达临床拟用剂量的数十倍甚至上百倍。受到动物给药体积的限制，有时只能采用最大可给药剂量（最大可以通过灌胃针、最大可灌胃体积）作为高剂量。而大剂量下（尤其是最大可给药剂量）毒性试验的结果存在一些问题：①由于给药剂量过大，影响了特定药物成分（尤其是含量不高的毒性成份）的吸收，从而影响药物毒性的暴露。对于化学药物，可以通过伴随毒代动力学实验分析药物吸收与体内暴露水平，而中药难以开展伴随毒代动力学的研究明确药物成分暴露水平。②在中药毒性试验中，常观察到高剂量组动物体质量降低，但有时难以区别这是药物的毒性效应还是灌药量大对动物摄食的干扰。大量给药量可引起动物胃肠道应激反应，造成的腹泻和食欲减退等［6］，可能影响动物营养吸收和正常发育，干扰试验结果，从而影响对中药安全性的判断。③大剂量给药量可能造成药物成分的吸收反而低于低、中剂量，尤其对于具有胃肠道刺激的中药，大剂量反而刺激胃肠道，加速排空，使药物在胃肠道停留时间短、未能充分吸收前就排出体外。因此，有时可以观察到中剂量组动物的毒性反应高于高剂量组的情况。综上，中药毒性试验中，过高剂量给药可能带来干扰，研究者需要在实验中总结经验，在保证不影响动物正常发育、不影响药物吸收等情况下，确定最佳毒性试验的给药剂量。

2.4 外用制剂非临床安全性研究的难点

外用制剂是指不经口服和注射给药，直接用于皮肤、黏膜或腔道的制剂，如常用的贴剂、膏剂、涂剂和喷雾剂等。外用制剂是中药制剂的特色之一，但常含毒性药材，如马钱子、川乌和草乌等。中药外用制剂药味多，成分复杂，且动物皮肤与人体皮肤（黏膜）在组织结构、生理特性和药物吸收等方面存在较大差异。因此，外用中药复方在毒性试验中如果能够充分模拟临床实际情况，如药物透皮吸收、药物与局部相互作用等，对于药物安全性的研究评价较为重要。当中药成分在动物体内缺乏暴露而在人体存在暴露时，动物试验结果难以预测人体毒性效应。

外用中药制剂非临床安全性研究的难点体现在以下方面：①药物成分经皮吸收较低时，对于化学药物与生物技术药物，可以考虑采用皮下注射的补充途径增加药物体内暴露。但外用中药制剂多为粗制剂，难以开展皮下注射，因此难以研究药物充分体内暴露下的毒性效应。一些外用制剂适用于破损皮肤，如何长期反复破损动物皮肤（黏膜）以增加药物吸收而又不损伤动物、干扰主试验，存在诸多技术难点［9-10］。外用制剂可选择小型猪、家兔和大鼠，但目前中药制剂较多选择大鼠和家兔，小型猪使用较少，而小型猪皮肤生理结构与人体最接近。②通过药代或毒代动力学试验获得经皮（黏膜）吸收中药成分的体内暴露信息目前存在较大难度，有主观原因也有客观原因，如当前技术法规的要求和检测技术难度大等。但对某些中药成分具有较大的安全性担忧时，应考虑毒性试验伴随毒代研究，以阐明药物体内暴露水平-毒性的量效关系。如马钱子中的生物碱士的宁和马钱子碱等具有神经、心血管系统毒性，检测这些成分的动物体内暴露水平并与毒性效应进行关联，对于准确评价药物安全性具有重要意义。③膏剂和贴剂等制剂存在载药量限制，有的外用制剂对动物皮肤接触性差，影响药物的经皮吸收。此外，受到动物可给药皮肤面积的限制，不能完全依靠增加给药面积以增加药物吸收。④如何保证外用制剂在给药部位的保留/停留时间是受试物能否充分暴露的因素之一［9］。例如，经腔道（阴道、鼻腔和直肠）途径的毒性试验，如何保障药物不会外流或排出、增加在腔道内的停留时间，是实验成败的关键因素之一。⑤动物毒性试验中，皮肤黏膜经常出现的局部症状如红斑和水肿等，有时难以辨别是药物刺激性还是过敏性所致，需要更深入的免疫毒理学研究才能加以甄别，如特异类型淋巴细胞的比例和腘窝淋巴结试验等［11］。

2.5 药效或药理关联效应在毒性试验中的缺失

化学药物或生物技术药物的非临床毒性试验中，往往观察到与药物靶点、药理作用机制和（或）药效学关联的毒性效应，这些毒性效应大多是放大的药效学效应、继发性效应和（或）药物的脱靶效应，都与药物自身相关，大多能够通过药效学、药理机制分析所产生的毒性及其机制。但是，在复方中药的药理学和药效学实验研究中，检测指标大多是抗氧化、抗炎、免疫调节、调节血糖（血脂）、改善微循环和激素（内分泌）调节等相关指标，从发表文献或新药申报资料均显示具有良好的药效学效应，相关检测指标显示良好的预期改变，有的中药复方甚至优于对照的化学药物，但这些药理或药效学效应在毒性试验中常常未能观察到。从笔者多年所研究评价中药的情况分析，仅少数中药表现出药效学关联的一些效应，如降血脂中药复方在毒性试验中动物可以表现出体质量减轻和甘油三酯降低的效应；具有免疫抑制作用的中药，在大鼠上可以观察到胸腺和脾脏萎缩和（或）淋巴结异常。上述现象的原因较为复杂，原因分析如下。

2.5.1 未能科学合理地设计针对性、指示性的毒性检测指标

由于对中药复方的药效物质基础与毒性成分不够清晰，加上研究者对药物毒性的预测分析力弱，往往难以设计科学灵敏的毒性检测指标，依赖肝肾功、血糖和血脂等常规指标难以反映药物的隐匿性毒性，尤其是早期、轻度的毒性发生时。中药疗效一般较为温和、缓慢，因此其毒性效应可能是一种远期效应，较为轻微，在这种情况下，科学合理地设计灵敏指标或早期生物标志物以探测潜在毒性，实际上对于中药毒性研究更应重视、更具有实际价值。例如，检测反映肾小球滤过功能的血清β2微球蛋白与血清半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、反映肾小管功能的β2微球蛋白、α1微球蛋白及肾损伤分子1等毒性标志物，可以更灵敏、早期地的识别肾损害，尤其是早期的功能变化，可以反映损伤位点与毒性机制。因此，较常规的血清肌酐和尿素氮更具有较好的先进性。这些毒性标志物现已成为美国FDA或EMA推荐的检测指标。

此外，复方中药药效学研究结果的可靠性也是较大的干扰因素。不可靠的药效学指标与结果有时会误导向毒性试验的桥接与转化，使毒性试验的设计指标既难以反映药效学作用、也难以探索到预期毒性。

2.5.2 复方中药的双向调节作用

中药的双向调节作用与其中所含的复杂成分与机体的相关作用有关。有些中药复方含有药理作用相互对立的药效成分，在不同病理条件下产生不同的药理作用，表现出双向调节作用。在毒性试验中，当药物作用于正常健康动物机体时，不同效应相互抵消。因此，中药药理或药效学的相关效应未能表现。例如，辛温解表的代表方剂麻黄汤中既含有兴奋中枢神经的麻黄碱，也含有抑制中枢的抑制成分桂皮醛；既含有扩张血管的成分桂皮油，又含有收缩血管的成分麻黄碱［12］。一些复方中药由于不同配伍呈现相反的药效学效应，例如四君子汤中的水溶性成分兴奋胃肠平滑肌，而脂溶性成分抑制胃肠平滑肌运动，两者协调则可以双向调节小肠运动［12］。桂枝汤的活性成分Fr.A和Fr.E能降低自发性高血压大鼠血压，而活性成分Fr.B能升高低血压大鼠血压，表明对血压的双向调节作用［13］。

2.5.3 中药的“倒钟型”效应

中药的“倒钟型”效应，即在一定剂量范围内表现出一定的药效学效应，但超过一定剂量后药效学效应反而降低，甚至丧失。以受体、酶和离子通道为靶标的药物可以表现出“倒钟型”效应：低剂量时激活这些靶标、产生相应的生物学效应，到达一定剂量后达到稳定的“平台”效应，再提高剂量后则产生抑制靶标的效应。这与不同剂量药物成分对靶点的激动或抑制效应、构像调节、脱敏效应、受体内在化效应以及占位饱和等不同的作用机制相关。毒性试验通常采用较大剂量给药以暴露药物毒性，在“倒钟型”效应的情况下，毒理学或放大的药效学效应可能表现不明显。

3 人体应用经验在复方中药安全性研究评价中的价值

复方中药制剂区别于化学药物、生物技术药物最大的特点是复方中药是在中医指导下的辨证施治，具有临床人体应用历史。一些经典名方、验方历时数百年的人体应用实践，累积了一些人体应用的信息资料，对其安全性有了初步了解和把握。对中药毒性的认知，有理解为中药对机体的损害，也有理解为中药偏性及由此产生的治疗效应。对于中药的非临床安全性研究，听到的一些争论是：人都“点头”了，还需要老鼠“点头”吗？言下之意，经过了临床人体实践的中药，还需要动物实验来裁决吗？不容否认，来源于临床实践的中药复方能够提供人体安全性的一些信息，为指导中药新药研发与临床试验提供有益的指导，对支持早期临床试验（如短时程的人体耐受性试验）可能具有较大价值。但对于支持扩大的临床试验（如长周期的临床试验和特殊人群等），降低或者简化中药非临床安全性的技术要求，除非有充分的科学依据，原因简要分析如下。

3.1 临床观察的全面性、科学性和准确性，决定了临床人体信息的价值

来源于临床的中药复方具有一定临床应用基础，但大多数临床观察并非遵循随机、对照、双盲的科学原则，往往是粗略的临床观察，且主要关注的是临床疗效或有效性，而对安全性并未进行全面、科学、细致的观察。对于一些急性或（和）严重的不良反应如急性或明显的肝、肾或胃肠道的毒性及明显异常的神经症状等，在临床实践中容易观察，但对于长期慢性、隐匿性的不良反应，简单的临床观察通常难以识别，如蛋白尿、脏器组织慢性纤维化、肾小管细胞变性坏死和QT间期延长等。随着药物应用时间的延长，毒性逐渐积累使得脏器功能失代偿、毒性效应明显爆发时才能觉察到。因此，如果缺乏科学、可靠、灵敏的检测手段与技术，隐匿性毒副作用难以通过望诊和问诊等方式加以识别。

3.2 潜在的遗传毒性、生殖毒性和致癌性等特殊毒性在临床实践中难以观察

无论对于中药、化学药物还是生物技术药物，其潜在的遗传毒性（致突变性）、生殖毒性（对亲代生殖功能与早期生育力、对妊娠期胚胎发育及对子一代生长发育的毒性影响）和致癌性等特殊毒性在临床实践中都难以观察。临床人体试验主要考察药物的一般毒性，需关注的是副作用或者危及生命的事件；特殊毒性的考察无论在方法、技术手段、伦理及可行性等方面都难以在临床试验中得到研究考察。例如，遗传毒性发生在基因（DNA）及染色体水平，也可以发生在非DNA（组蛋白）水平——表观遗传机制。遗传物质的损伤肉眼看不见，摸不着，也非人体能够感知，需要借助现代技术手段才能检测到。关木通、广防己及其相关制剂引起的肾功能衰竭和肾肿瘤的事件就是一个很好的例子［14］。马兜铃酸及其代谢物在肾、肺等组织蓄积明显，直接损害肾细胞，导致肾功能受损及慢性间质纤维化。随着科学技术的发展，近年才发现马兜铃酸能够插入肾细胞DNA形成DNA加合物，从而造成DNA损伤。服用积聚量高的患者肿瘤发病率高，在所有几十例患者的肾组织中均检出马兜铃酸-DNA加合物，有研究提示为马兜铃酸与人p53基因嘌呤碱基反应［15］。这些研究首次从分子机制阐明了马兜铃酸的遗传毒性，为阐明其致肾肿瘤机制提供了科学依据。药物诱导的肿瘤形成是一个长期过程，DNA加合物的识别也只能应用现代科学技术才能发现。因此，不难理解这些特殊毒性需要特定的科学研究才能发现。

3.3 对产生毒性的原因与机制了解甚少

在临床应用过程中，即便发现中药的一些不良反应，也大多停留在对临床事件的了解层面，对产生毒性的原因与机制了解甚少。而非临床安全性研究不仅仅可以识别药物毒性，而且能够通过追加试验，在动物整体水平、细胞水平乃至分子水平深入解析毒作用机制。这对于药物毒性进入临床试验的风险评估、毒性的预防、监测与控制，都具有重要的指导意义。

3.4 现代中药提取制备工艺与传统工艺的差异，也会带来安全性的风险或担忧

传统复方中药的提取制备方法主要是煎煮法。一般中药提取技术采用水提、醇沉，但随着现代分离提取技术的发展，形成了大孔吸附树脂法、超临界萃取法和液相气相色谱法等新技术，实现对中药成分的提取、分离与纯化，并达到显著提高特定成分含量的目的。例如，利用大孔吸附树脂分离西洋参果肉总皂苷，可以使总皂苷含量超过50%［16］。但需要关注的是，这些现代提取工艺的应用虽然显著提高富集了有效成分，也会使潜在的有害有毒成分浓缩富集；或者使传统工艺未能提取出来毒性成分在新工艺提取出来。因此，在传统工艺中未显出的药物毒性，在应用现代工艺后药物的毒性可能表现出来。此外，中药复方制剂在炮制、提取等制备工艺过程中，一些成分可能发生改变或者引入新物质、杂质等，都有可能成为复方中药制剂的毒性原因。因此，前人在中药复方的应用中获得有关人体安全性的信息，还需要根据实际使用的制备工艺加以分析。

4 中药新药非临床安全性研究和评价的思考

4.1 复方中药非临床安全性研究技术要求的发展变迁

当前，复方中药一般只要求一种动物（常为大鼠）的单次与重复给药毒性试验（以前称为长期毒性试验），其中重复给药毒性试验对于中药非临床安全性的判定最为重要。对中药非临床安全性研究的技术要求可以追溯至1992卫生部药政管理局颁布的《中药新药研究指南》，该指导原则指出“对于中药新药制剂，各味药材符合法定标准，无特殊工艺，无毒性药材，一般进行大鼠长毒试验。如无明显毒性反应，则可以免做犬长期毒性”。1999年，国家药品监督管理局颁布《中药新药研究的技术要求》，其中对复方中药非临床安全性研究的要求与1992年颁布的技术要求基本一致，但对毒性试验给药周期从“给药期为临床疗程的2倍”调整为“3～4倍”，这是一个较大技术要求的提升。2005年，CFDA颁布中药、天然药物非临床安全性研究的多项指导原则，明确了在GLP条件下进行中药非临床安全性研究。该指导原则最大的特点与提升是引入了国际理念与国际技术标准，技术要求与FDA和人用药物注册技术要求国际协调会（ICH）的相关指导原则基本相同，在实验项目、检测指标以及实验设计的科学性与系统性等方面，质与量显著提升，这对于提升我国中药非临床安全性研究的水平与规范性起到极大的促进作用。该指导原则中指出：“中药复方制剂，可先进行一种啮齿类的长期毒性试验，当发现明显毒性时，再采用第二种动物（非啮齿类）进行研究。若该类处方中含有毒性药材、无法定标准药材或有十八反、十九畏等配伍禁忌时，则应进行两种动物（啮齿类和非啮齿类）的长期毒性试验。2014年，CFDA颁布了药物非临床安全性研究的多项指南，没有区分化学药物与中药，但对复方中药的非临床安全性研究评价，在附件进行备注，基本内容与2005年的技术要求相同。总体来看，中药新药非临床安全性研究评价是在参考化学药物的基础上，学习、借鉴并结合中药复方特点发展形成当前的指导原则。

从上述毒性试验指导原则的变迁可以看出，从1992年至今，对中药复方非临床安全性研究的技术要求基本没有大的变化，最主要的实验研究仍然是一种啮齿类动物（大鼠）的重复给药毒性试验。在实际研究评价工作中，采用另一动物种属（如犬）进行复方中药重复给药毒性试验的情况较少，只有对含有大毒药材的中药复方或者大鼠毒性试验结果存在不确定的毒性判断时，会要求进行犬重复给药毒性试验。

4.2 复方中药非临床安全性研究技术要求的思考

安全、有效是药物的核心要素。为了保障药物安全，国际社会（尤其是美国、欧洲和日本）历经数十年的科学研究与评价实践，形成较为成熟、完善的药物非临床安全性研究技术体系，为保障药物安全与人类健康发挥巨大贡献。这一现代毒性评价体系是基于现代医学、生命科学、动物医学、组织病理学、临床病理及分子生物学等学科形成的综合性交叉学科与技术体系，适用于所有与人体健康的产品，如药物、农药、食品、化妆品和医疗器械等。尽管对于不同的产品，所要求毒性试验项目、实验内容及检测指标存在差异，但安全性研究的思想与原则基本相同，即采用全面、科学和灵敏的技术方法检测其潜在毒性，预测人体风险。

前面已提及，现代药物非临床安全性研究的技术要求主要包括2种动物种属的单次给药、反复给药毒性试验、毒代动力学试验、安全药理学试验、生殖毒性试验、遗传毒性试验、致癌试验、依赖性试验、局部毒性和过敏性试验等。作为药品上市，安全、有效的共同属性决定了中药复方在非临床安全性研究中的理念与目标和化学药物、天然药物及生物技术药物并无差别。复方中药的中药配伍和人用经验可以提供中药安全性的一些参考信息，但难以取代非临床安全性研究，尤其是慢性、隐匿性毒性的识别；遗传毒性、生殖毒性乃至致癌性的排除，更需要严谨的非临床试验研究。此外，前人对中药复方的临床应用大多建立在辨证论治的个体基础上，而中药成药面对的是庞大的患者群体，不同患者个体在年龄性别、病理生理、药物吸收与代谢、遗传因素、体质与营养状态以及证候改变等方面都不尽相同。因此，系统的非临床安全性研究对于保障用药安全具有重大意义。

美国FDA颁布的《植物药研究指导原则》中指出，植物药的人用经验对于安全性的判定具有参考价值，可支持植物药进入初期临床试验，但对于扩大的临床试验和批准上市前必须有严格设计、完整的非临床安全性研究资料［17］。例如，2006年美国FDA批准上市的第一个植物药Veregen，是由绿茶中提取的以茶多酚为主的外用植物制剂。上市前进行了包括安全药理学、局部耐受性、全身毒性、遗传毒性、生殖毒性、致癌性、药代动力学及毒代动力学等多种属、多途径的系列毒性试验研究。

4.3 一般毒性试验中动物种属选择的考虑

两种动物种属的重复给药毒性试验是当前国际业内的共识。啮齿类（大鼠）、非啮齿类（犬）动物具有不同的遗传、生理、生化和药物代谢等特性，因为药物在这2种不同种属的毒性效应可能不同。Olson等［18］大量的调查与总结表明，采用啮齿和非啮齿2种动物进行毒理学试验，所表现出来的毒性反应和人体的毒性反应之间的一致性可达71%，而单用啮齿动物毒性试验，其研究结果和人体不良反应的一致性概率仅为43%，单用非啮齿动物的一致性概率为63%。因此，为了增加动物实验预测人体毒性反应的全面性和准确性，保障临床试验受试者安全，美国、欧洲和日本等药品监管部门对药物一般毒性试验都要求采用2种动物种属进行；支持I期临床试验可以进行短周期的毒性试验（如4周毒性试验），但上市前需完成更长周期的安全性实验，这已经成为全球工业界、药物监管机构及研究者的共识。

由于中药成分的多样性和复杂性，难以通过动物药代动力学和体外代谢研究以筛选敏感的实验动物。长期以来，中药复方新药一般采用1种动物种属（大鼠）重复给药毒性试验。应用大鼠和犬进行的重复给药毒性试验，各有优点，也有局限性。大鼠与犬相比，动物样本量大，技术操作方便，易于管理。但单独的大鼠毒性试验也存在以下局限：①大鼠毒性试验难以观察药物对心血管系统的影响，如心电图、血压和心率等，如果进一步缺乏对心血管系统安全药理学研究，则可能造成在心血管毒性评价的缺失，因为仅仅靠心血管脏器组织的病理学检查，难以全面评价心血管系统毒性尤其是功能性改变。心血管系统毒性是化学药物常见毒性之一，也是上市药物撤市的重要原因，应予以重视。心血管系统的相关指标可以在犬重复给药毒性试验中伴随观察，而且能够实时动态的监测，如采用马夹遥测技术等。②大鼠对胃肠道药物毒性不如犬敏感，可能造成药物对胃肠道影响的忽视，尤其当缺少胃肠道安全药理学试验时。③群养的大鼠对于神经精神系统的观察不如单笼饲养的犬适宜。犬较容易观察到神经、精神及运动功能的异常。④大鼠重复给药毒性试验周期最长为6个月，而犬可以做到9～12月。因为大鼠6个月毒性试验对于临床用药周期长、或者反复用药的中药新药可能不足，如治疗高血压、糖尿病、慢性阻塞性肺气肿及肝纤维化等的药物，这种情况下更长周期的犬毒性试验可以更充分暴露药物的潜在毒性效应。

在单用大鼠进行的毒性试验中，有时会遇到模棱两可的毒性结果，加上缺乏药物成分、药物体内暴露量和药物作用机制等信息，对安全性的判断陷于两难状况。例如，药物组动物出现轻度蛋白尿的比例略有增加（对照组也有尿蛋白），血清肌酐、尿素氮和肾组织病理等其他所有检测指标均未见异常。在这种情况，只能结合组方药材、有无毒性药材、制备工艺、药理作用、人用史、临床适用人群与适应症以及用药周期等方面进行综合分析，但这些也仅仅是推测分析，缺乏科学依据。判断的科学性更多取决于研究者或审评者的工作经验与科学水平。如果具有另一种动物种属的毒性试验，对这些可疑结果将起到重要的印证作用。

综上，采用2种动物种属（一种啮齿类，另一种非啮齿类）进行一般毒性研究对于保障药物临床安全性具有重要意义。不可否认，与化学药物不同的是，来源于临床的复方中药新药往往具有或多或少的人体应用的信息，但正如本文前面所提到的，粗略、不规范的临床观察难以获得科学、全面、可靠及可溯源的临床安全性数据，而且对于隐匿性、慢性的毒性损害难以在临床观察中发现。笔者认为只有在获得科学、规范的临床数据的基础上，才能考虑非临床安全性试验的简化或减免。

4.4 疾病模型动物与健康动物应用的思考

病理状态下的疾病模型动物与正常健康动物存在差异，其体质状态与患者可能更为接近。因此，一些观点认为采用疾病模型动物进行毒性试验，与中药强调的辨证施治较为吻合。有研究比较了大黄（主要含有大黄素和大黄酸）在正常大鼠和CCl4肝损伤模型大鼠的毒性表现，发现肝损伤模型大鼠对大黄的毒性反应低于正常动物［19-20］。造成这一现象的机制是肝损伤动物对大黄中蒽醌类成分的组织分布和代谢特征与正常动物不同，肝损伤模型动物肝组织将其他蒽醌成分转化代谢为肝肾毒性相对较大的大黄酸的能力显著低于正常动物肝组织，因此反而不易发生肝肾毒性。有研究也发现，大黄给予正常或肝受损的大鼠连续12周后，大黄酸、大黄素和芦荟大黄素在肝受损大鼠的肝、脾及肾的水平显著低于正常大鼠，提示肝损伤模型动物对大黄潜在毒性降低［21］。对α异硫氰酸萘酯诱导的急性淤胆型肝炎大鼠给予一定剂量的赤芍、芍药苷及白芍苷，其体内药代动力学参数如t1/2，AUC0–t，AUC0–∞，tmax及Clz/F等与正常大鼠也明显不同，这可能是肝损伤大鼠毒性反而降低的原因［22］。这些研究支持了“有病病受之，无病体受之”、《黄帝内经·素问》“有故无殒，亦无殒”等观点。上述研究提示，中药药理学、药效学和（或）药代动力学在疾病模型动物与健康动物的效应可能不同，但目前在这个领域积累的数据很少，尚未形成规律性认识，仅限于很少量的实验研究。因此，当正常动物的毒性试验结果与预期结果（或临床实践）存在较大差异时，积极探索中药在正常动物与疾病模型动物中的毒性差异及其原因，不仅对于中药新药的研发具有意义，而且对于科学解释与认识中药毒性具有重要意义［23］。

当前国际上尚无将疾病模型动物应用于药物毒性试验专门的指导原则，但在ICH指南中提及疾病模型动物在药物安评中的应用。ICH（2011）指出，或许可以采用模拟临床疾病的动物模型进行药物安全性研究，动物模型可以是自发性也可以是诱发性动物模型，如疾病模型动物、基因敲除动物及转基因动物。疾病模型动物的应用可能对于解释更接近临床实践的潜在毒性与体内代谢具有意义，甚至对判断药物的安全性具有决定性意义，例如是否加重原有疾病［24］。尽管这个指导原则主要针对生物技术药物，但从科学理念来看也应适用于中药。ICH（2005）指出，动物模型或许可以用于心律失常药物的安全性评价［25］。ICH（2009）有关抗癌药物的非临床安全性研究指南中，并未提及模型动物应用，但仍然有一些采用荷瘤小鼠进行安全性评价的实验研究［26］。

4.5 关注肝、肾之外其他脏器系统的毒性研究

肝、肾是药物代谢与排泄的主要器官，其毒性发生概率高于其他脏器。因此，药物毒性试验中比较重视对肝、肾的毒性研究［27］。目前已知具有肝、肾毒性的中药不少，如大黄、吴茱萸、何首乌、山豆根和雷公藤等［28］。大黄所含的大黄素等蒽醌类成分具有肝、肾毒性，何首乌水提组分或醇提组分都具有剂量效应的肝毒性。复方中药报道具有肝、肾毒性的复方中药，如壮骨关节丸、疳积散和青黛胶囊等［29］。肝、肾毒性的识别，除了依靠组织病理学的经典指标外还有血清指标，如反映肝细胞组织结构的谷丙转氨酶和谷草转氨酶，反映肾功能的尿素氮和肌酐等，这也是中药肝、肾毒性相对易于识别的另一个原因。由于中药物质基础的复杂性、毒性作用及其机制的未知性和复杂性，除了肝、肾等常见毒性靶器官外，还应重视对胃肠道系统、免疫系统和生殖内分泌系统等的影响，这与中药多成分、多靶点和多作用机制的特点有关。

胃肠道是口服中药进入体内的首个处置脏器，具有一些特定理化特性的中药对胃肠道可能具有直接或间接的影响。例如，性味苦寒的中药会影响胃肠道的功能；祛风湿药可引起消化系统的不良反应，这可能与其中所含的乌头碱（或其他生物碱）及具有细胞毒性的二萜环氧化合物有关［30］。这类药物应关注胃及十二指肠黏膜上皮的组织病理改变。追加的胃肠道安全药理学试验，如体外回肠收缩和胃排空时间等指标，对于进一步明确药物的作用特点具有帮助。一般情况下，犬胃肠道对药物的刺激或反应的敏感性高于大鼠。

中药成分复杂，对免疫和生殖内分泌等多功能复杂系统的影响需关注，尤其含有免疫抑制功能的中药材［31-32］。例如，雷公藤中所含的雷公藤总生物碱和雷公藤甲素等具有明确的免疫抑制作用，昆明山海棠也具有明确的免疫抑制作用，这些作用可以在动物毒性试验中表现出来，如观察到胸腺与脾萎缩、淋巴结病理损害等。中药的免疫增强（激活）的效应在正常健康动物不易观察到，但应该注意一些局部效应。例如，笔者团队进行的某一治疗上呼吸道感染复方中药的大鼠1月重复给药毒性试验，尽管该中药复方都是常见中药材，但发现肠系膜淋巴结窦内红细胞增多，推测与该药物刺激胃肠道免疫功能有关。

心脏毒性也不容忽视。采用基于核磁共振的心脏、肝及血清代谢组学研究发现，蟾酥可引起心肌细胞氧化应激、线粒体功能及能量代谢的紊乱，表明其心脏受损，从机制上解释了蟾酥引起心肌组织病理改变［33］。采用基于UPLC-Q-TOF-MS的代谢组学研究黑顺片及其联用瓜蒌、浙贝母、白莲或白芨等的心脏毒性。结果发现，黑顺片或其联用复方都可引起心肌代谢组异常［34］。附子和贝母在临床常用于心肺相关的疾病，但按照中药配伍理论，由于附子和贝母不合，不能配伍使用。在野百合碱诱导的肺动脉高压大鼠中，附子和贝母合用可以改善肺动脉高压早期大鼠的肺功能和肺病理变化；但随着疾病进展至晚期，右室扩张及心肌细胞凋亡反而加重，这与抑制3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶以及激活蛋白激酶A介导的信号通路等机制有关［35］。

笔者团队研究评价过的中药新药，尽管都是一些常见中药材组方的复方中药，但也会发现一些不常见的病理变化，这些改变可能与复杂、未知的中药成分有关。例如，某一拟用于治疗肝损伤并伴有转氨酶升高的复方中药，发现大鼠子宫内膜增生和子宫内膜呈分泌期改变；某一治疗糖尿病复方中药的毒性试验中，发现大鼠脱毛、表皮增生和毛囊萎缩等；某一治疗肠易激综合征复方中药的毒性试验中，发现大鼠股二头肌纤维变性萎缩，大鼠后肢无力。这些毒理效应难以从中药成分、药理作用机制或药效学等角度进行科学分析，是中药毒理学的研究难点。中药新药的研发一般以注册申报上市为目标，许多研发单位一般不愿投入资金进行毒性机制的探索研究，且一旦出现明显毒性后研发单位即终止试验。因此，有关中药新药毒性及其毒性机制的文献报道非常少。综上，除肝、肾等常见药物毒性靶器官，中药新药对于其他器官系统的毒性研究也不容忽视。

4.6 关注生殖毒性

生殖毒性关系到人类生殖健康以及下一代的成长与健康，应给予足够重视。自从20世纪沙利度胺（反应停）所致“海豹儿畸形”的惨剧发生后，国际社会对药物生殖毒性的研究内容与技术要求不断完善，形成了目前较为系统的生殖毒性研究技术体系，研究内容包括从早期生育力（生殖细胞和生殖能力）、胚胎发育（致畸敏感期）到子代发育（围产期）的生育与发育过程。正是由于现代药物生殖毒性试验体系的建立与实施，“海豹儿畸形”事件发生后在全球范围内再未出现重大生殖毒性的“药害”事件。

中医妇科是中医药的特色专业，古代医者较为重视中药的生殖毒性，根据临床经验编制“妊娠禁忌歌”，在一些复方中药记载妊娠禁用、忌用或慎用，体现了对生殖毒性进行风险等级控制的意识。明显的生殖毒性如早产和流产等，容易在临床中观察，但大多数生殖毒性无法在临床中进行研究与识别，如生殖细胞（精子和卵细胞）的发育与成熟、受精卵着床、早期胚胎发育、胚胎畸形（外观、内脏和骨骼畸形）、子一代发育与精神神经功能等，基本依赖于非临床生殖毒性的实验研究。目前对复方中药尚未要求进行生殖毒性研究，只有对保胎、促孕和性功能障碍等特定适用人群的中药要求进行部分生殖毒性试验研究，如大鼠生育力与早期胚胎发育生殖毒性试验、大鼠致畸敏感期生殖毒性试验等。没有经过规范生殖毒性的试验研究，就没有数据科学评价中药的生殖毒性。对于化学药物如此，中药同样也如此。

有学者调查研究了台湾市立妇女儿童医院1984-1987年入院孕妇（妊娠期大于26周）的用药历史、分娩和新生儿状况等，共计分析了14 551例新生儿。排除混杂因素后，发现在妊娠第一个周期服用过黄连的孕妇与增加的胎儿神经系统畸形风险有关，服用过安胎饮的孕妇与增加的骨骼肌及结缔组织畸形风险有关［36］。多种中药材的生殖毒性已被现代实验所证实，如茵陈蒿、川桂皮、牡丹皮、苦参、山慈菇、半夏、水蛭、杜仲、雄黄、千里光、紫草、红花、大黄、大戟、扶桑、九节菖蒲、羌活、洋地黄和连翘等。例如，半夏及其炮制品具有小鼠胚胎毒性，以生半夏为甚［37］；大黄具有较强的大鼠生殖毒性［38］；高浓度（大于15 mg·L-1）人参皂苷Rb1可直接导致大鼠胚胎畸形［39］。山慈姑对生殖细胞有较强的致突变作用［40］。中药生殖毒性的原因可能与其中所含的一些成分有关，如生物碱、苷类、毒蛋白、动物毒素和酚类等。例如，雷公藤中所含的雷公藤总生物碱、雷公藤多苷及雷公藤甲素等具有明显的雄性生殖毒性，具有睾丸毒性，引起睾丸病变［41］。含毒蛋白类的天花粉、含毒素的僵蚕和含酚类的酚酸等具有明显的生殖毒性；含重金属有机汞、砷之类中药的生殖毒性也不容忽视［41］；麝香酮具有终止妊娠的作用［42］。对盐附子、生川乌和生草乌的大鼠生殖毒性研究，发现可引起睾丸和附睾脏器系数减小，但睾丸组织未见异常［43］。有学者研究了20种孕妇常用中药材对小鼠的生殖毒性，如白术、菟丝子、续断、阿胶、桑寄生、甘草、黄芪、白芍、当归、杜仲、党参、山参、生地黄、艾叶和陈皮等，其中一些中药材可观察到有益的效应，如促进胎鼠身长、增加一窝胎仔数量等，但一些中药也观察到毒性效应，如妊娠早期的生殖毒性，尤其是增加母鼠围产期死亡率［44］。采用胚胎干细胞研究黄白术、板蓝根和黄连的致畸性，黄白术和板蓝根未见胚胎毒性，但黄连具有弱的胚胎毒性［45］。综上，没有经过规范生殖毒性的试验研究，就没有数据科学评价中药的生殖毒性。对于化学药物如此，中药同样如此。

中药复方生殖毒性的研究报道较少，这可能与长期以来对中药生殖毒性的不重视有关。昆明山海棠胶囊具有一般生殖毒性［46］；千里光及其复方制剂千柏鼻炎片对大鼠胚胎具有致畸作用［47］。笔者团队在风湿平胶囊大鼠I、II阶段的生殖毒性试验中，发现雄鼠睾丸生精细胞发育不良、精子减少及精子畸形，干扰雌鼠受精卵着床、引起胎鼠骨骼发育缓慢。上述研究结果可以看出，对于含有毒性药材或具有潜在遗传或生殖毒性药材的复方中药、具有免疫抑制效应的复方中药，进行生殖毒性试验研究具有重要意义。除此之外，对于含有干扰细胞代谢成分的中药、含重金属的矿物药、有较强活性的活血化瘀药、泻下药、破气药、辛热药和滑利药等，也应结合临床适用人群考虑进行生殖毒性试验，以排除潜在的生殖风险。实际上，中药新药复方制剂审评过程中也暴露出一些常用中药材的组方存在生殖毒性的情况，如对雌雄大鼠生育力的不良影响、延迟胎鼠的骨骼发育等。

胎盘屏障对药物成分的阻隔功能不如血脑屏障，大多数物质都能够进入胎儿血循环，可能对胎儿发育造成损害。例如，巴豆水提取液能够通过小鼠胎盘屏障，诱发骨髓及胚胎肝细胞染色体损伤［48］。因此，对于适用于妊娠期妇女的复方中药，进行致畸敏感生殖毒性、围产期生殖毒性试验对于保障妊娠与胎儿安全、子代健康都很有必要。

4.7 关注遗传毒性

药物遗传毒性是指各种作用机制直接或间接引起遗传物质DNA的损害，从而引起体细胞或生殖细胞的突变。遗传毒性可以导致致癌性、致畸（胚胎致死和胚胎畸形）、代谢障碍分子病及生殖障碍等遗传性疾病。一方面，药物的遗传毒性涉及致癌和致畸性，也涉及子孙后代的健康，是一种远期与隔代效应；另一方面，遗传毒性的损伤水平发生在基因水平，这类毒性效应在临床难以识别与防控。遗传毒性试验致癌预测性为60%～90%，90%以上致癌物遗传毒性试验为阳性结果。因此，遗传毒性试验是药物非临床安全性研究评价的重要内容。药物遗传毒性主要通过组合毒性进行测试，常用方法包括以遗传基因突变为指标的试验（细菌回复突变试验和小鼠淋巴瘤细胞TK基因突变试验）、以染色体畸变为观察终点的试验（微核试验和染色体畸变试验）和以DNA损伤为观察终点的试验（单细胞凝胶电泳检测）［49］。

遗传毒理学是近几十年来随着分子生物学的发展才形成的现代毒理学分支学科，建立在遗传学、分子生物学、细胞生物学及分子毒理学等学科的基础上，直至21世纪，国际社会也才将药物遗传毒理学的研究策略、实验方法逐渐标准化。我国20世纪70年代末至80年代初开始引起国外遗传毒性试验技术，开展技术推广与规范化，并初步应用于健康相关领域。至90年代，我国开始建立遗传毒理学学科。因此，不难理解尽管古人记载了不同类型的中药毒性信息，但未曾记载遗传毒性，这与古人认识水平与检测技术的局限性有关。

近年有关中药遗传毒性的研究报道日益增加。半夏、细辛、板蓝根、杜仲茶、紫草、商陆、山慈菇、斑蝥、雄黄、吴茱萸次碱、昆明山海棠和柠檬苦素等中药或其制剂，遗传毒性试验一项或多项为阳性。例如，姜半夏汤剂在20和30 g·kg-1剂量下可导致小鼠胎肝微核率及DNA受损率显著提高，具有一定的致突变作用［50］。细辛与板蓝根水煎液能明显诱发小鼠骨髓嗜多染红细胞微核和小鼠精子畸形，具有致突变作用［51-52］。采用Ames试验、SOS/Umu试验、DNA交联试验、彗星试验和外周血网织红细胞微核试验等研究发现，杜仲茶可能具有致小鼠血淋巴细胞DNA单链断裂作用［53］。采用小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验和小鼠胚胎肝细胞转移微核试验，发现中药紫草水煎液［54］和商陆水煎液［55］具有剂量效应关系的遗传毒性。腹腔注射山慈姑提取物会导致小鼠精子畸变率升高［40］。雄黄对小鼠骨髓嗜多染红细胞有致突变作用，对CHL细胞染色体具有致畸变作用［56］。吴茱萸次碱和柠檬苦素也表现致突变性［57］。昆明山海棠胶囊具有遗传毒性［46］。这些研究充分表明，应重视中药遗传毒性的研究，因为一旦作为新药上市，难以监控与防控。

笔者认为，现阶段应重视下列类型中药的遗传毒性研究：①含有干扰核酸代谢、细胞分裂和细胞周期等成分的复方中药。例如，马兜铃酸引起DNA加合物的形成，从而造成肝、肾细胞损伤，引起器官组织纤维化甚至肿瘤形成［15］。抗肿瘤中药中的细胞毒性成分具有损伤正常细胞DNA的潜能。②某些含有重金属的复方中药。有学者采用彗星试验检测到朱砂对大小鼠染色体的损伤效应、导致遗传毒性［58］。③含有明显免疫抑制成份的复方中药。由于免疫抑制后可能降低机体的免疫监视能力，对受损DNA及突变细胞的清除能力减弱，从而导致遗传毒性的累积。④中药注射剂会因为缺少首过效应和胃肠道屏障，增加毒性成分与人体细胞DNA相互作用的几率并发生突变的可能性。⑤适用于妊娠期或妊娠前期使用的中药。

遗传毒性的组合试验中，有相当一部分是细胞或细菌的体外试验，如Ames试验、细胞染色体畸变试验、TK基因突变试验等。由于多数复方中药为成分复杂、不溶物多，加上渗透压、pH和含有组氨酸等原因，使复方中药难以进行体外遗传毒性试验。但随着现代新技术、新方法的出现，上述体外试验已经具有良好的体内替代试验，能够评价相同的遗传终点。例如，经国际协调验证后的体内DNA损伤试验（体内彗星试验）可以评价药物对脏器细胞DNA的损伤效应，而且还能够将药物吸收与代谢的因素考虑在内，与人体有更好的一致性。因此，完善的遗传毒性组合试验可以最大限度地排查复方中药潜在的遗传毒性，保障用药人群健康。

4.8 加强有毒中药的基础研究

有毒中药几千年的应用历史与其基础研究的薄弱不相符，而且一些有毒中药的毒性报道与基础研究首先多由国外发现，然后才引起国内关注。中药及其制剂产生毒性的原因多种多样，但有毒药材是复方中药产生毒性的重要原因之一。例如，洋地黄、万年青、八角枫、蟾酥和夹竹桃等含强心苷类的药材能够增强心肌收缩，减慢心率，具有潜在的心脏毒性；木通、黄药子和商陆等含皂苷的中药材可能抑制呼吸，导致心、肾损害［59］。此外，不同的中药品种，药效和副作用也大相径庭。例如，广防己和粉防己都属于防己，前者是马兜铃科，含有毒性成分马兜铃酸，而后者却是防己科，未有报道其含有马兜铃酸［60-61］。矿物药、重金属药及相关中药复方的毒性研究也需要丰富科学内涵，如砒霜、朱砂和牛黄解毒丸等［62-63］。因此，科学表征每一味中药的毒性是安全使用中药的重要依据。例如，美国及欧洲国家限制千里光及其相关制剂的使用，因其所含的吡咯里西啶类生物碱超出世界卫生组织限定的、可能导致肝毒性的含量［8］。当前，我国对有毒中药毒性分级沿用历代本草的经验进行分类，或者以LD50值的大小以判断其毒性等级，这些不仅缺乏科学、客观的实验数据依据，而且与实践情况存在出入。我们对多数有毒中药及其毒性成分的认识不足，对毒性成分的毒性效应更是远未认识，判断其允许使用的限量范围，需要科学、合理、充分的非临床或临床数据。因此，应当系统性加强有毒中药材毒性的基础研究以及GLP条件下的非临床安全性研究，明确其毒性成分、毒性特点和毒性靶器官，明确量-效关系和量-毒关系，在基于安全性研究数据的基础上，建立有毒中药的毒性等级标准、质量控制标准。经过10～20年的成果累积，逐步建立、健全常见有毒中药材的安全性数据库，这不仅仅对中药新药研发具有良好的指导意义，而且对于我国新药审评机构的审评具有重要的参考价值。

复方中药中的有毒中药材或毒性成分不代表其就具有毒性；反之，在非临床研究中，复方中药出现毒性也并非复方中单味药材或毒性成分效应的简单总和。复方制剂可以通过炮制减毒、配伍减毒，使复方中药的毒性效应消除或降低，从而避免对机体的毒性损害，这是复方中药的一大特点。配伍减毒在临床与中医理论中有较多的阐述与应用，但非临床的基础研究很少，尤其缺少GLP条件下规范的基于毒性成分与体内暴露的实验研究、毒性成分之间相互作用的研究、毒性成分的拆方研究以及毒性成分的毒代动力学研究。因此，除了理论与临床实践外，应加强非临床研究，采用科学的实验数据求证中药的“配伍减毒”、“炮制减毒”。在现代科学与客观实验数据的基础上继承并发展控毒理论和技术，是有毒中药非临床研究的重要课题。

有时人们对有毒中药材存在先入为主的不当认知。一些看似有剧毒的药材，在非临床动物试验中并未出现预期中的较强毒性；而一些长期使用、看似安全的中药，却存在较大的安全隐患。例如，川乌水提物对模型动物的生长发育无明显影响，对其造血系统无明显毒性，在高剂量下才具有肝、肾及心脏毒性［64］。笔者曾对某一含有不可口服大毒药材的复方中药进行过系统的非临床毒性试验研究。在犬连续灌胃3个月的毒性试验中，除了胃肠道黏膜出现一些病变及异常神经症状外，未见其他明显毒性；犬心血管系统的安全药理学试验，也未见对心血管系统的影响。相反，以往认为毒性较低的中药材却发现较大毒性。例如，何首乌的肝毒性［65］；三七的肝肾毒性、神经毒性和细胞毒性［66］；葛根提取物可导致小鼠肝细胞坏死，升高谷丙转氨酶和谷草转氨酶活性，可导致体外体外培养的HepG2细胞及小鼠原代肝肝细胞受损，释放乳酸脱氢酶，这与其上调Mt1基因及凋亡基因Bax有关［67］。

5 中药非临床安全性研究的展望

中药作为中华民族的瑰宝传承至今，历经千百年临床实践，逐步完善、形成了独特的医疗体系。中药毒性也并非时至今日才发现。“神农尝百草”是对中药安全性的原始观察，是以人体经验判断为主，形成“神农尝百草，日遇七十毒”的传说。如今，中药学科日渐完善，形成了中药炮制、中药药理学和方剂学等分支学科。随着现代科学的飞速发展，中药毒性的研究技术与方法也长足进步，从最初简单的急性毒性试验、长期毒性试验发展到血清药理（毒理）学、毒代动力学、分子毒理学、影像毒理学和组学等领域，使人们更全面、清晰地认识中药的安全性。当前中药安全性研究仍存在诸多问题与难点亟待解决，应充分利用现代生命科学（由于是现代医学）技术方法，全面、系统地考察中药非临床安全性。值得提出的是系统生物学，它包括基因组、转录组、蛋白组、代谢组或脂质组，适合中药复杂成分、多靶点和多层次的研究。与传统毒理学方法相比，系统生物学技术可易于探索发现中药毒性作用机制、毒性通路和毒性靶器官，易于探索发现潜在的毒性生物标志物，甚至可以作为中药复方作用机制研究的补充和验证［67-69］。

对于中药安全性的研究与评价，应基于全面、科学、客观的研究数据，不能夸大中药毒性，也不能忽视规范、全面的非临床安全性研究。通过非临床动物试验获取全面的、科学的数据，做好中药毒性风险（效益）评估，趋利避害，有利于在临床试验期间实施必要监测方案，早期识别毒性、防控人体不良反应。只有探索建立符合中药特点的技术评价体系，科学地制定中药非临床安全性监管与审评策略，加强规范化中药安全性的研究与评价，才能促进中药的继承与创新发展，才能保障患者用药的安全有效。

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Consideration on non-clinical safety evaluation of traditional Chinese medicine

CEN Xiao-bo1,HAN Ling2

（1.National Chengdu Center for Safety Evaluation of Drugs,West China Hospital, Sichuan University,Chengdu 610041,China;2.Center for Drug Evaluation, China Food and Drug Administration,Beijing 100038,China）

Safety，efficacy and quality control are the three essential elements for drugs，including traditional Chinese medicine（TCM）.Currently，rapid development of life sciences，medicine and phar⁃macy provides new prospects for TCM.Considering the long history of TCM application，modern phar⁃macology and toxicology，global standards and expectations on the safety of TCM，how to evaluate the safety of TCM scientifically has become a key to the research and development of TCM. This review aims to discuss current technical requirements of non-clinical safety study of TCM as well as the challenges.

non-clinical safety evaluation;traditional Chinese medicine;toxicity

HAN Ling，E-mail：hanl@cde.org.cn

R99,R285.1

A

1000-3002-（2016）12-1343-16

10.3867/j.issn.1000-3002.2016.12.013

Foundation item：The project supported by National Science and Technology Major Project of China（2012ZX09302-004）

2016-12-01接受日期：2016-12-15）

（本文编辑：齐春会）

国家科技重大专项（2012ZX09302-004）

韩 玲，E-mail：hanl@cde.org.cn